用DNA芯片检测siRNA专一性[创新技巧]

DNA芯片检测siRNA专一性

生物通编译，未经许可请勿转载 2003.06.12 （生物通）又是一篇RNAi文章，虽然并没有重大结果，不过其思路对当前的RNAi热也有点启发吧。     长片断的双链RNA (dsRNA) 导入例如植物，真菌，果蝇，线虫等生物的细胞中会引发同源mRNA的降解——这就是所谓的RNA interference (RNAi)。RNAi分两个步骤，首先是长片断双链dsRNAs被核酶Dicer切割成21—25个碱基的small interfering RNAs (siRNAs)。这些siRNA随后和相关蛋白组合成为RNA-induced silencing complex (RISC) ，这个复合物以同源mRNA为靶摧毁mRNA。两年前Elbashir and Tuschl用siRNA在哺乳动物细胞中成功引发特异基因的沉默，从此siRNA广泛应用于这个领域。    siRNA介导的基因沉默通常要求高度的序列专一。Tuschl和同事证实siRNA和mRNA之间一个碱基的错配都会导致基因沉默的失败，当然这并不排除由siRNAs 引发的非特异基因沉默。siRNAs也有可能会引发一系列的部分同源的mRNAs沉默，甚至有可能象超过30个碱基的长片断dsRNA一样通过引发抗病毒反应—— 一种通常由于机体对抗病毒入侵产生的反应，包括由蛋白激酶R和后继的EIF2a磷酸化激活的蛋白合成阻断，以及由 RNase L激活的非特异RNA降解。     这就意味着需要在全基因组范围内对siRNA的专一性进行检测。2003年5月出版的The Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, Patrick Brown和同事采用DNA芯片的方法对siRNAs的专一性在全基因组范围内进行了检查。      Brown和同事检查了两个针对外源GFP基因的siRNAs的专一性，结论是关闭外源的GFP表达不会间接影响其他细胞内源基因的表达水平。2个GFP特异的siRNAs和两个随机无意序列对照siRNAs分别被转染能瞬时或者持续表达GFP的人源293细胞，结果通过GFP荧光水平检测和FACS分析，GFP特异的siRNAs能够沉默70%的GFP表达而对照则对GFP表达没有影响。从转染和没有转染siRNAs的细胞中分离RNA，标记后和点有36000个人类基因的cDNA 芯片杂交。其中约有20000个基因在293细胞中表达。结果表明这20000个基因中没有一个的表达水平在转染了特异或非特异siRNAs后发生显著变化。（生物通按：之所以选择针对外源基因的siRNAs来研究siRNA是否会间接影响其他内源基因的表达，是由于关闭外源基因表达本身不会引发内源基因表达水平的变化，某个内源基因的表达沉默会引起整个基因相互作用网络中一系列的相关基因表达模式的变化，目前还难以判断这种变化是由于靶基因表达沉默引起的还是由于siRNAs的非特异性引起的）     对于RNAi 特异性的另一个关注焦点是：传递的RNAi（"transitive RNAi"）或者叫’secondary siRNAs’的产生。Transitive RNAi是在线虫的实验中发现的，也可能在其他生物中发生。在这个过程中，siRNAs，在变性后结合到互补的转录本上，通过RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase ，RdRP)在3’和5’端的延伸形成新的双链dsRNAs。这些dsRNAs被加工成为’secondary siRNAs’。这些二级siRNAs，如果和其他基因有同源，可以导致其他基因表达的沉默，这样就强化了非特异基因沉默的可能性。     到目前为止，在人类基因组中没有发现 RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)，这提示在人类细胞中可能不会发生RNAi传递。然而这个假设并没有被广泛的验证过。Brown和同事也检测了在人源细胞中是否存在传递RNAi现象。他们将两个报告基因(luciferase and GFP)分别和常见的actin序列融合，共转染到293细胞中。他们检测到一个报告基因的特异的siRNAs不能导致另一个报告基因沉默。结果表明传递RNAi机制在人类中不存在。     研究结果支持已有的假设：siRNAs在高度序列专一的条件下发挥作用，只能导致完全互补的基因表达沉默。人类细胞不存在传递RNAi现象的实验结果同样证实这种专一性。     不过实验受限于细胞类型和siRNAs类型，特别是外源基因的siRNAs。实验结果仍然有待推广到其他细胞类型，特别是内源基因的siRNAs，如果siRNAs在将来要应用于基因治疗，这样的实验将尤为重要。 References Elbashir SM, Harborth J, Lendeckel W, Yalcin A, Weber K, and Tuschl T (2001). Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in mammalian cell culture. Nature 411:494-498. Elbashir SM, Martinez J, Patkaniowska A, Lendeckel W, and Tuschl T (2001). Functional anatomy of siRNAs for mediating efficient RNAi in Drosophila melanogaster embryo lysate. EMBO 20 (23): 6877-6888. Chi J-T, Chang HY, Wang NN, Chang DS, Dunphy N, and Brown PO (2003). Genomewide view of gene silencing by small interfering RNAs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (early online edition, 2 May 2003).