RNAi 技术路线选择及应用[选购宝典]

　　近年来的研究表明，一些短片断的双链RNA可以通过促使特定基因的mRNA降解来高效、特异的阻断体内特定基因表达，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，称为RNA干扰（RNA interference，RNAi）。siRNA（small interfering RNAs）就是这种短片断双链RNA分子，能够以序列同源互补的mRNA为靶目标，降解特定的mRNA。RNAi的发现具有划时代的意义，它不仅深入揭示了细胞内基因沉默的机制，而且它还是后基因组时代基因功能分析的有力工具，极大地促进了人类揭示生命奥秘的进程。现在越来越多的研究人员开始采用RNAi来研究生物体的基因表达。RNAi技术可广泛应用到包括功能基因组学，药物靶点筛选，细胞信号传导通路分析，疾病治疗等等。
RNAi研究的一般技术路线是：

　由上述的路线可以看出，获得高纯度的siRNA产物是进行实验的第一步，而转染的效率则是非常关键的因素。

一、siRNA的设计
　　在制备siRNA 前都需要单独设计siRNA序列。研究发现对哺乳动物细胞，最有效的siRNAs是21-23个碱基大小、3‘端有两个突出碱基的双链RNA；而对非哺乳动物，比较有效的是长片段dsRNA。siRNA的序列专一性要求非常严谨，与靶mRNA之间一个碱基错配都会显著削弱基因沉默的效果。

选择siRNA靶位点：
　　从转录本AUG起始密码子开始，搜寻下游AA序列，记录跟每个AA 3’端相邻的19个核苷酸作为候选的siRNA靶位点。有研究结果显示GC含量在30%—50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。Tuschl等建议在设计siRNA时不要针对5’和3’端的非编码区（untranslated regions，UTRs)，原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果。

序列同源性分析:
　　将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。例如使用BLAST（ www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）选出合适的目标序列进行合成。并非所有符合条件的siRNA都一样有效，其原因还不清楚，可能是位置效应的结果，因此对于一个目的基因，一般要选择3-5个靶位点来设计siRNA。
通常来说，每个目标序列设计3—4对siRNAs，选择最有效的进行后续研究。

设计阴性对照：
　　一个完整的siRNA实验应该有阴性对照，作为阴性对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。通常的做法是将选中的siRNA中的碱基序列打乱。当然，同样要保证它和其他基因没有同源性。

此外网上提供免费的siRNA设计工具www.qiagen.com/siRNA, http://bioinfo.clontech.com/rnaidesigner/ 

二、siRNA的获得

1. 化学合成定制siRNA 
　　尽管化学合成siRNA是最贵的方法，但却是最方便的——研究人员几乎不需要做什么工作就可以拿到高质量的siRNA。如QIAGEN-Xeragon公司可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA（可带标记）。它最适用于的情况是：已经找到最有效的siRNA序列，需要大量siRNA进行研究。QIAGEN还提供siRNA设计合成一体化服务“4-for Silencing siRNA duplexes” ：针对客户给出的一个基因序列，由QIAGEN的专家设计并合成4对siRNA，HPP纯度，保证至少一对抑制效率达到70%以上，如果达不到，免费为客户另行设计合成另外4对siRNA。

Figure 1. HeLa-S3 cells were plated out in 24-well plates at a density of 6 x 104 cells in each well, 24 hours after transfection. Cells were transfected with lamin A/C siRNA using the transfection reagents indicated, according to the manufacturer’s protocol. mRNA was purified from the cells 48 hours after transfection and quantitative RT-PCR was performed using the QuantiTect SYBR Green RT-PCR Kit with primers targeted to lamin 

2. 体外转录法合成 siRNA
长链dsRNA合成
　　如果研究对象不是哺乳动物细胞，可以采用较长的双链RNA诱导RNAi现象。我们可以DNA Oligo为模版，通过体外转录合成dsRNAs，成本相对化学合成法而言比较低。目前市场上有很多这样的体外转录试剂盒，像NEB，EPICENTRE都提供类似的试剂盒。

特异性siRNA合成
　　多数生物尤其是哺乳动物，siRNA仍是诱导RNAi的最佳选择。以DNA Oligo为模版，通过体外转录合成siRNAs，成本相对化学合成法而言比较低，而且能够比化学合成法更快的得到siRNAs。值得一提的是体外转录得到的siRNAs毒性小，稳定性好，效率高，一般只需化学合成的siRNA量的1/10就可以达到同等的效果。这类方法主要适用于：筛选siRNAs，特别是需要制备多种siRNAs，以及化学合成的价格成为障碍时。Epicentre MessageMuter™ shRNAi Production Kit能高效地合成特异shRNA直接用于转染细胞，详见本刊“Epicentre最新的转录专家”介绍。

非特异性siRNA合成
　　特异性制备siRNA的方法的不足，是需要设计和检验多个siRNA序列以便找到一个有效的siRNA。而用这种方法——制备一份混合有各种siRNAs “混合鸡尾酒” 就可以避免这个缺陷。这个方法通常选择200—1000碱基的靶mRNA模板，用体外转录的方法制备长片断双链dsRN A ，然后用RNase III (或 Dicer)（大肠杆菌RNase III是一种识别双链 RNA的内切酶，产物为 3’端外悬2-3个碱基的双链短片段）在体外消化，得到siRNAs“混合鸡尾酒”。在除掉没有被消化的长链dsRNA后，这个siRNA混合物就可以直接转染细胞，转染方法和特异性siRNA一样。由于siRNA混合物中有许多不同的siRNAs，通常能够保证目的基因被有效地抑制。NEB公司的ShortCut™ RNAi Kit，就是采用此类方法的试剂盒。

　　非特异性siRNA合成，尽管特异性不强，无法确知有效靶片段，但相对经济，基因沉默效率高；可以跳过检测和筛选有效siRNA序列的步骤，为研究人员节省时间和金钱。不过这种方法的缺点也很明显，就是有可能引发非特异的基因沉默，特别是同源或者是密切相关的基因沉默。

3．siRNA表达载体
　　化学合成与体外转录方法都是在体外得到siRNA后再导入细胞内，但是这两种方法主要有两方面无法克服的缺点：siRNA进入细胞后容易被降解；进入细胞siRNA在细胞内的RNAi效应持续时间短。针对这种情况，出现了质粒、病毒类载体介导的siRNA体内表达。该方法的基本思路是：将siRNA对应的DNA双链模板序列克隆入载体的RNA聚合酶III的启动子后，这样就能在体内表达所需的siRNA分子。这种方法总体的优点在于不需要直接操作RNA，能达到较长时间的基因沉默效果。

　　通过质粒表达siRNAs大都是用Pol III启动子启动编码shRNA(small hairpin RNA)的序列。选用Pol III启动子的原因在于这个启动子总是在离启动子一个固定距离的位置开始转录合成RNA，遇到4—5个连续的U即终止，非常精确。当这种带有Pol III 启动子和shRNA模板序列的质粒转染哺乳动物细胞时，这种能表达siRNA的质粒确实能够下调特定基因的表达，可抑制外源基因和内源基因。采用质粒的优点在于，通过siRNA表达质粒的选择标记，siRNA载体能够更长时间地抑制目的基因表达。当然还有一点，那就是由于质粒可以复制扩增，相比起其它合成方法来说，这就能够显著降低制备siRNA的成本。

　　此外，带有抗生素标记的siRNA表达载体可用于长期抑制研究，通过抗性辅助筛选，该质粒可以在细胞中持续抑制靶基因的表达数星期甚至更久。目前BD CLONTECH公司的RNAi-Ready表达载体就是这样的产品（原理如下图）。

　

　　同时RNAi-Ready表达载体还能与逆转录病毒和腺病毒表达系统整合（BD Knockout RNAi Systems），大大提高siRNA表达载体对宿主细胞的侵染性，彻底克服某些细胞转染效率低的障碍，是实现哺乳动物细胞siRNAs瞬时表达与稳定表达的理想工具。

　

Figure 4. Transfected RNAi-Ready pSIREN vectors suppress luciferase expression. Luciferase expression is suppressed in HEK 293 cells containing the functional luciferase siRNA. Panel A. Lysates were run on a 12% polyacrylamide gel, Western blotted, and probed using an anti-luciferase antibody (1:2,000 dilution). Panel B. The same Western blot was probed with an anti-b-actin antibody (1:2,000 dilution) to control for sample loading. Lane 1: circular vector alone. Lane 2: vector containing luciferase siRNA insert. Lane 3: vector containing negative control siRNA insert.

　　最近新推出的带有荧光标记的siRNA表达载体更是广受到研究者的重视与欢迎。因为带荧光标记的表达载体，可以使我们通过荧光标记很容易观察到载体的转染效率及目的基因的沉默效率。可通过荧光显微镜观察含有shRNA的细胞或通过流式细胞仪富集被转染的细胞。同时荧光蛋白的表达与shRNA的表达是独立的，因此不影响shRNA基因沉默的效果。下面这个图就是使用BD CLONTECH的RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen 和 pSIREN-DNR-DsRedExpress Vector转染HEK 293 细胞的结果。 

Figure 5. Fluorescent RNAi-Ready pSIREN vectors generate effective, tagged shRNA expression cassettes (SECs). Using the BD™ Knockout RNAi Clone & Confirm PCR Kit, fluorescence-tagged SECs were generated by PCR from ligation mixtures of a negative control (–) or a luciferase (+) shRNA annealed oligo, and an RNAi-Ready pSIREN vector with a fluorescent marker. The PCR-generated SECs were subsequently cotransfected with pCMV-Luc into HEK 293 cells. Luciferase activity was measured 48 hours after transfection. Shown are ZsGreen-tagged (Panel A) and DsRedExpress-tagged (Panel B) SECs in cotrans-fected cells. The SECs effectively knock down luciferase expression by >85% (Panel C).

4. siRNA表达框架
　　siRNA表达框架(siRNA expression cassettes，SECs)是一种由PCR得到的siRNA表达模版，包括一个RNA pol III启动子，一段发夹结构siRNA，一个RNA pol III终止位点。它能够直接导入细胞进行表达而无需先克隆到载体中。和siRNA表达载体不同的是，SECs不需要载体克隆、测序验证等颇为费时的步骤，可以直接由PCR得到，不到一天就可完成。因此，SECs是筛选siRNA的最简单有效的工具，可作为构建高效的体内转录载体进行RNAi研究的预实验，对不同宿主细胞优化筛选转录启动子和siRNA靶序列。如果在PCR两端添加酶切位点，那么通过SECs筛选出的最有效的siRNA后，可以直接克隆到载体中构建siRNA表达载体。构建好的载体可以用于稳定表达siRNA和长效抑制的研究。

　　这个方法的主要缺点是PCR产物比较难转染到细胞中。如果有适合的新型转染试剂能提高SEC的转染效率的话，那可以解决很大问题。另外，不能进行序列测定，PCR和DNA合成时可能差生的误读不能被发现，可能会因此导致结果不理想。

三、转染细胞
　　由于siRNAs是进入细胞后才能对蛋白的表达进行抑制，因此如何高效地将siRNAs转入细胞也是成功抑制基因表达的关键步骤。例如，一个siRNA分子对某特定基因的抑制效率为90%，而转染效率为10%，那么最后抑制蛋白表达最后的效率只有9%，可见如何提高siRNAs的转染效率非常重要。目前传统转染方法与转染试剂盒很难达到高效率的siRNAs转染，效果都不理想。QIAGEN公司的RNAiFect是专门的RNAi转染试剂，它的原理基于脂质体技术，适用于多种真核生物细胞，如AGS，HEK-293，HeLaS3，Huh-7，HUVEC，NIH-3T3等等（具体效果见Figure 1）。而且该试剂的细胞毒性很低（Figure 6）。

Figure 6. Cells were transfected and LDH activity in the cell culture supernatants was tested 48 hours later, using a colorimetric assay according to the manufacturer’s protocol. LDH activity in the cell culture supernatant of untransfected cells lysed by detergent was set to 100%. Background LDH activity was measured in untransfected and untreated cells, and this value was subtracted from all other measurements.

　　对于siRNA表达载体与表达框架等DNA的转染，可以选用常规的DNA转染试剂。

四、分析RNAi的效果
　　RNAi分子水平的检测主要通过mRNA和蛋白两个方面进行检测。对于mRNA，可以采用 RT-PCR，定量PCR，或Northern杂交等，通过信号强弱判断目的基因的沉默效果。由于生命的执行者是蛋白，因此还需要对蛋白水平进行检测，可通过Western杂交，ELISA，免疫荧光等。当然RNAi最大以及最终的效果是细胞的代谢过程、生理生化系数等表型参数发生明显的变化。

　　与传统的基因敲除等基因沉默技术相比，RNAi技术具有投入少，周期短，操作简单等优势。近来RNAi成功用于构建转基因动物模型的报道也日益增多，标志着RNAi将成为研究基因功能不可或缺的工具。不仅如此，RNAi技术还将可能成为研究细胞信号传导通路与基因治疗的新途径。