Peptide-Carrier™ Kit

［助你的多肽一臂之力］ 随着对蛋白质研究的深入，人们发现，即使只有几个氨基酸残基的多肽，也可能具有完整蛋白的某些性质。如今，越来越多的研究人员开始利用合成多肽制备抗体或作为酶反应底物（我公司同时提供多肽合成服务，具体收费标准请参见后页）。但是，由于多肽分子量过小，没有免疫原性，不能有效地刺激机体产生抗体，或者难于检测，限制了多肽在 Western Blot 或其它免疫反应中的应用。 NEB 最新推出的 Peptide-Carrier™Kit 可以解决以上问题，通过将目的多肽与一个载体蛋白结合，使多肽能够成功应用于Western Blot，ELISA、多肽芯片检测、激酶检测等。 Peptide-Carrier™ Kit的应用： ■ 制备 Western blot 反应的阳性对照 ■ 制备高灵敏度的多肽芯片 ■ 制备蛋白修饰底物 ■ 连接带有天然或非天然氨基酸的多肽 Peptide-Carrier™ Kit组成： ■ 载体蛋白CP39 (Western): 50次反应 ■ 对照肽PB1: 50 祃 ■ 载体蛋白反应缓冲液: 0.5 ml ■ 3×SDS样品缓冲液: 0.5 ml ■ 操作手册 应用实例1：Peptide-Carrier™Kit 用于血凝素(HA)丙氨酸突变筛选实验 合成 9条N端含有半胱氨酸的血凝素短肽，其中一条含有从 Tyr98到Ala106的野生型序列，能与特异性抗体反应，另外8条则分别用 Ala 取代第1-8位氨基酸。所有短肽与 CP39 (0.8 mg/ml)连接后，分别在微孔板上用PBS稀释。连接产物与未连接的对照样品在0.45 祄硝酸纤维素膜上进行印迹实验。印迹斑点采用抗血凝素的单克隆抗体检测。结果显示：第1，2，4和5位置的氨基酸对抗体识别极为关键，未连接载体蛋白的裸肽没有检测到信号。 A B 图1: A) 血凝素合成肽库。合成9条N端含有半胱氨酸的短肽(P1-P9)，其中 P9 含血凝素从 Tyr98 到 Ala106 的野生型序列，P1-P8则分别含有一个丙氨酸突变。 B) 斑点印迹实验分析连接和未连接载体蛋白的血凝素表位肽。P1-P9 肽连接到载体蛋白CP39上(CP39-HA)。将连接产物 CP39-HA(1-4行)和未连接的HA肽(5-8行)转印到硝酸纤维素膜上。转印后的硝酸纤维素膜采用抗血凝素的单克隆抗体进行检测 (CellSignaling Technology, 1:2000稀释)。

应用实例2: Peptide-Carrier™ Kit 用于酶修饰检测实验 以检测Abl蛋白酪氨酸激酶的磷酸化活性为例，合成含有磷酸化位点且 N 端为半胱氨酸的多肽 (CGSNEAIYAAPFAKKK),与CP39载体蛋白连接后产物用Abl蛋白酪氨酸激酶(NEB #P6050)进行磷酸化修饰，随后采用抗磷酸化酪氨酸的抗体(Cell SignalingTechnology)进行Western blot分析。只有经Abl激酶处理的连接产物才能产生阳性信号(图2: 3, 4泳道)。 图2: Abl 蛋白酪氨酸激酶活性分析。合成含有磷酸化位点且N端为半胱氨酸多肽(CGSNEAIYAAPFAKKK), 并与CP39 载体蛋白连接。连接后产物用Abl蛋白酪氨酸激酶(NEB #P6050) 进行磷酸化修饰, 随后采用抗磷酸化酪氨酸的抗体进行 Western blot 分析。 Lane1: CP39 Lane2: CP39+ AblKinase (100 Units) Lane3:CP39-Peptide + AblKinase (50 Units) Lane4: CP39-Peptide+ AblKinase (100 Units) Lane5: CP39-Peptide Lane6: Abl Kinase (100Units) 图3: 考马斯亮蓝染色SDS-PAGE分析多肽连接p53肽和对照肽PB1分别连到载体蛋白 CP27(27kDa)和CP39 (39kDa)上。样品经12% SDS-PAGE电泳分离，考马斯亮蓝染色分析。 Lane1：CP27 Lane2：CP27+p53（1.8 kDa） Lane3：CP27+PB1（2.8 kDa） Lane4：CP39 Lane5：CP39+p53（1.8 kDa） Lane6：CP39+PB1（2.8 kDa） Peptide-Carrier™Kit工作原理： C 端带有活性硫酯基 团的载体蛋白与 N 端 带有 Cys 残基的多肽 混合后，发生酯基转 移反应，产生硫酯中 间产物。随后中间产 物自发进行 S-N 酰基 转移，形成正常的肽 键，从而有效连接两 个蛋白(多肽)。 多 肽 合 成 服 务 纽英伦生物技术（北京）有限公司现提供优质的多肽合成服务，可与 NEB 的 Peptide-Carrier™ Kit 配套使用，也可以单独使用。对于需要纯化的多肽，我们提供质谱鉴定和 HPLC 纯度检验报告，并在接到订单后 2-4 周内交货；非纯化多肽的货期为2周左右。 多肽合成价格(人民币元/aa) 产量 序列长度 粗肽 >85% >90% >95% 5 mg 8~30 - - 390 420 10 mg 8~30 180 330 430 465 20 mg 8~30 210 375 480 510 30 mg 8~30 2 40 450 540 600 50 mg 8~30 285 600 750 825 100mg 8~30 330 900 975 1100 多肽修饰价格（人民币） N端乙酰化(Acetylation) 150 C端酰胺化 (Amidation) 280 N端加生物素 (Biotinylation) 700 磷酸化 (Serine, Threonine or Tyrosine) 3500 交联蛋白 (KLH) 2200 交联蛋白 (BSA) 2200 交联蛋白 (CP27)* 1000 *与CP27进行交联的多肽N端必须为半胱氨酸 快速进行多肽药物筛选——Ph.D.噬菌体展示肽库 噬菌体展示原理： 噬菌体展示技术是将外源多肽或蛋白与噬菌体的一种衣壳蛋白融合表达，从而使多肽能够展示在病毒颗粒的表面，展示在噬菌体表面的多肽配体与各种靶分子(抗体、酶、细胞表面受体等)通过一种被称为淘(panning)的体外选择程序得以快速筛选鉴定。噬菌体展示技术构建的文库容量大，可进行多次“淘选”富集，十分适用于高通量筛选，因此可以广泛应用于蛋白质相互作用分析等方面的研究，也是进行多肽药物筛选的重要手段。 噬菌体展示肽库可以方便、快速、高通量地筛选多肽配体，并将其应用到生命科学诸多领域。因而得到众多科研人员的认可。NEB提供的 Ph.D 噬菌体展示肽库试剂盒采用M13溶原性噬菌体作为载体，无需裂解细胞，纯化步骤简单方便，利于快速淘选，文库稳定性好，测序简便。 图4: 噬菌体展示肽库的工作原理 应 用： ■ 筛选抗原表位 ■ 蛋白质相互作用分析 ■ 筛选酶的底物或抑制物 ■ 筛选受体激活物或抑制剂 ■ 药物研发 试剂盒组成： ■ ~2 x 109个不同序列文库 ■ -28 gIII测序引物（人工测序） ■ -96 gIII测序引物（自动测序） ■ E.coli宿主细胞ER2738 ■ 链霉亲合素和生物素 ■ 详细操作说明 试剂盒组成： NEB 提供三种随机肽库：Ph.D.-7、Ph.D.-12 和Ph.D.-C7C。在一般情况下，我们建议您先从Ph.D-7肽库开始您的实验。也可以三种肽库同时使用。Ph.D.-7 文库是线性随机7肽文库，含有 2.8 x 109个独立克隆，基本上包括了所有可能的随机7肽序列。Ph.D.-12文库是线性随机12肽文库，含有1.9 x 109个独立克隆，只包括了可能的随机12肽序列（2012 = 4.1 x 1015）中的小部分。适用于结合位点不超过 7 个残基但分布在12肽序列的小肽筛选。Ph.D.-C7C 环肽库也是随机7肽库，含有 3.7 x 109个独立克隆，文库中的每个小肽形成环状，可能改善小肽与配体的结合。  细胞色素P450酶类（CYP450s） 细胞色素 P450 酶家族 (CYP450s) 是一类含亚铁血红素的蛋白质，参与人体中许多外源化合物(包括药物)的转化过程，对生物体内的新陈代谢起着非常重要的作用，因而引起了人们的广泛关注。现有超过 90% 的药物都需要细胞色素 P450酶家族的参与才能进行代谢，因此可以用于药物筛选。在人的肝脏中有大量的 II 型同工酶，这些酶都是膜结合蛋白，它们需要 NADPH-细胞色素P450还原酶存在的情况下才能发挥作用。 NEB目前提供5种高纯度的重组人肝脏 CYP450 酶，可用于药物毒理实验、药物相互作用和药物剂量研究，以及体外药物筛选。采用这些酶可以测试潜在的药物是否能被CYP450代谢，还是会抑制CYP450的作用。 NEB提供的P450细胞色素酶有如下优点： ■ 纯度高 ■ 品质稳定，批间差小 ■ 使用方便—以膜片形式提供，无需悬浮于脂滴中。并与人NADPH-CYP450还原酶共表达以获得较高的酶转化效率。 ■ 同时提供无CYP450的E.coli膜片作为阴性对照。 图5: 用 5 种 hCYP450 测试某种潜在药物， 发现 hCYP3A4 能修饰该药物分子

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