更快克隆出重组表达质粒——Invitrogen(下)[选购宝典]

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Gateway技术是Invitrogen近几年一直在推广的一种位点特异重组的克隆技术。技术如其名，你需要进行表达就需要跨进一个门槛，只好你跨进这个门槛之后你就可以在许多不同的表达载体之间进行切换。Gateway™技术是基于已研究的非常清楚的λ噬菌体位点特异重组系统（attB×attP→attL×attR）。BP和LR两个反应就构成了Gateway™技术（见下图）。BP反应利用一个attB DNA片段或表达克隆和一个attP供体载体之间的重组反应，创建一个入门克隆。LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应。LR反应用来在平行的反应中转移目的序列到一个或更多个目的载体。这样你只要一个入门克隆，就可以把目的片段在原核细胞中表达、杆装病毒、哺乳动物细胞、酵母双杂交系统中进行表达，而且无需重复测序。

另外还有一个也是基于T7系统的表达载体，T7 based系统。它大体的表达调控方式与冠军系列是相同的。但是它是利用lac操纵子对T7 DNA聚合酶进行调控，而不是RNA聚合酶。同时，由于推出时间较早，因此没有运用TOPO技术和Gateway技术。

 

硫氧还蛋白系列

自从上个世纪80年代以来，硫氧还蛋白这种广泛存在于酵母、植物、哺乳动物中的蛋白就被应用于原核表达系统中。将外源蛋白与硫氧还蛋白一起表达可以帮助正确形成二硫键，使蛋白更加容易融合表达。Invitrogen的硫氧还蛋白是经过改造的，它31位和63位的谷氨酸被改造成为组氨酸，然后它们可以和第7位的组氨酸形成一个斑块（patch）。这个组氨酸斑块与二价阳离子有高度亲和力。外源蛋白因此可以被金属螯合树脂纯化。另外还有一种更简单的纯化方法，就是渗透休克法。如果硫氧还蛋白能够正确定位到对渗透压敏感的区室时，那么就可以通过渗透休克释放出一定量的重组蛋白。操作的方法十分简单，只需配渗透压力不同的溶液1和2，将培养适度的细菌收集起来，先在冰上用溶液1孵育10分钟，然后转为溶液2孵育10分钟，收集上清就可以了。如果不想过柱那么麻烦，可是先试试这种方法。

这一系列载体利用trc启动子，是trp－lac复合型起到子，它同时运用到色氨酸和乳糖操纵子两种模型对基因转录进行调控。因此，这一系列载体也是使用IPTG诱导表达的。这系列有pThioHis A、B、C三种载体，在多克隆位点上略有不同。

紧控开关系列

有些外源蛋白对细胞毒性很强，同时由于外源蛋白表达表达速度过快就会导致包涵体的形成，产生没有活性的蛋白形式。pL系列和pBAD系列都是基于以上原因产生的。pL系列是利用来自λ噬菌体的左启动子pL，cI基因可以抑制它的转录。cI抑制子位于细菌染色体上，它受到色氨酸操纵子调控。因此这一系列的表达是受色氨酸诱导，随着色氨酸浓度的升高，cI基因转录渐渐被抑制，从而pL启动子可以开始进行转录。

pBAD系列载体也是严谨控制的表达系统，这一系列融合了定向TOPO技术和Gateway技术。这个系列的载体是受到阿拉伯糖操纵子严谨调控的。当没有阿拉伯糖存在的时候，AraC蛋白以双聚物形式存在，使O₂和I₁位点联合起来形成一个210bp的环，抑制了转录（见下图）。加入了阿拉伯糖后AraC蛋白会释放O₂位点转为和I₁附近的I₂结合，这样使转录可以进行。转录同时需要cAMP激活蛋白（CAP）－cAMP复合物结合到DNA上，促使AraC与I₁、I₂的结合。如果在培养基中加入葡萄糖，那么这种表达就会被抑制。葡萄糖可以降低cAMP的浓度从而降低CAP的结合。当外源蛋白毒性非常强或抑制细菌生长的时候，这种严谨的调控模型就十分利于表达。

 

Invitrogen除了以上各种不同的表达载体，还有纯化相关的产品，在这里就不一一详诉了。

Invitrogen的表达系统有许多，包括杆装病毒、酵母表达、双酵母杂交系统等等都是十分出色的。在原核表达这一块它也尽量融合进了最近开发的定向TOPO技术和Gateway技术来增加系统的含金量。一分钱一分货，定向TOPO载体一般都不能重复使用，这样每次克隆的成本都会上升。但是当实验规模较大，需要重复较多的时候，使用这些技术能把你从无止境的酶切、连接中拯救出来。各中利弊需要你自己衡量咯。（生物通作者 谢菲）

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