[心得点评]2D电泳结果疑难解析

    生命科学领域发生的革命性变化，对生命活动的研究正在从传统的还原式研究转向了整体性的研究——以基因组学（功能基因组学）和蛋白质组学为基础的系统生物学。其中蛋白质组学包括表达蛋白质组学（expression proteomics）、结构蛋白质组学（structural proteomics）和功能基因组学(functional proteomics)。而双向电泳则是蛋白质组学，尤其是表达蛋白质组学的经典方法。

    由于双向电泳对于许多研究人员来说是个陌生的技术，所以一旦在电泳染色后出现费解的电泳图是件令人头痛的事：不知道问题出现在哪，也不知道如何去改正。这里来自GE公司的专家列出了几种常见出错电泳图，虽然不是非常全面，但是如果您也在实验中遇到了这样的问题，希望能从这里得到参考。

首先，来看看漂亮的2D电泳图

问题1. 氨基甲酰化（Carbamylation trains）导致太多蛋白斑点串，不属于常规的磷酸化等修饰

可能原因：尿素（urea）不纯

建议：用更纯的尿素，避免样品加热，或者用Amberlite IRN-150L去异氰酸盐（isocyanate）

问题2. 蛋白样品制备步骤错误导致蛋白丢失

可能原因：样品制备TCA/丙酮沉淀后用预冷的丙酮洗涤沉淀，导致TCA残留

建议：用90%丙酮/10%H2O洗涤,可以彻底洗去TCA


问题3.不同的样品制备步骤导致完全不同的蛋白斑点图谱

    对于样品制备而言，没有一个固定的方法，更多的时候要根据样品的特性，以及一些文献的参考进行优化，下面是一个植物样品的例子：

若采用常规的标准裂解液，样品溶解不充分	用甲醇沉淀后复溶，效果也不明显	TCA/丙酮沉淀较适合这一样品

4.正常情况

正常情况，右边的垂直条带包含了所有pIs值>pH7的蛋白。



问题5. 样品含高丰度蛋白导致出现水平条带

可能原因：高丰度蛋白聚集后，若采用胶面朝下的胶条槽，易造成水平条带。

建议：采用杯上样胶条槽或manifold等胶面朝上的胶条槽。

　

问题6. 出现水平条带（窄pH范围胶条）

可能原因：聚焦不够，或者盐离子过多

造成水平条带的其它原因：

1. Detergent去污剂浓度过低
2. 尿素浓度过低
3. DTT浓度过低，或者用量过少
4. 上样位置不合适（比如cup loading）
5. 蛋白酶活性
6. 胶条溶胀时间过短
7. 样品中含有不溶的蛋白(centrifuge 1 hr / 40,000 g)
8. 空气中的CO2

问题7. 试剂不新鲜

可能原因：TEMED不新鲜。

建议：尽管TEMED用量很少，还是建议每年更换一瓶TEMED。

　

问题8.试剂质量影响蛋白斑点成像

可能原因：Tris质量不好

问题9. 步骤错误导致蛋白丢失

可能原因：蛋白转移电压过高（400V，18cm胶）——在开始的45分钟内不要超过2W/gel（Ettan size）

问题10. 植物样品制备

可能原因：多糖未去除干净，被考马氏亮蓝染色

建议：样品用clean-up处理

问题11. 蛋白斑点出现垂直条带

可能原因：平衡过程中DTT不足，导致一些蛋白出现垂直条带。


问题12 样品中含盐等离子过高

可能原因：样品中含盐等离子杂质过高，导致等电聚焦失败。

建议：避免过多盐，需除盐，如在洗细胞时要把PBS在离心后彻底移除，或在最后一步清洗时采用250mM蔗糖/10mM Tris 洗细胞。


问题13 pH6－11的胶条

Rehydration Loading Cup loading

建议：对于碱性pH范围胶条，用杯上样效果更好


问题14 保存第二向凝胶时温度太低


可能原因：保存第二向凝胶时温度太低， SDS有沉淀

建议：长时间保存（2days - 2weeks）在4－8oC， 在二向进行前应提前把凝胶取出，室温放置。

如有更多问题，欢迎到生物通bbs讨论。（以上胶片由GE Healthcare专家提供）