解析复旦本期Cell文章之实验手段

　　

生物通报道：12月2日的Cell杂志刊登了来自中科院上海生命科学研究院生化与细胞所和复旦大学药理研究中心的合作研究发现的有关β抑制因子作为受体信息载体将调控信息传入细胞核的打破常规β抑制因子作用的新功能的文章，这一重要研究受到了Cell杂志三位审稿专家的好评，认为这一发现“描绘了一条新的信号传递通路并发现了β抑制因子的新的、意想不到的功能”，“是G蛋白偶联受体信号转导研究的一项重大进展”和“一项影响面很宽、将引起广泛关注和轰动的研究结果”。

β抑制因子1(β-arrestin-1） 是调节β-肾上腺素能受体功能的视紫红质抑制蛋白家族的一个成员，它是通过阻止机体内最大一类受体——G蛋白耦联受体信号传导的进一步进行，改变受体结构使其与其它信号分子相连的的一种重要调控因子。复旦大学药理研究中心的马兰教授与中科院上海生命科学研究院生化与细胞所的裴钢院士通过在之前的偶然发现阿片类药物与细胞膜上受体结合后能促使β抑制因子从细胞质快速迁移到细胞核内，在这一作用的基础上进而他们发现进入细胞核内的β抑制因子能够引起染色体重构并诱导药物靶基因激活，从而对细胞功能产生长期的调节作用。这一种重要发现揭示了受体信息传递和药物作用的一条新通道，也为开发治疗各种复杂疾病的药物提供新策略和靶点。

在这一研究中，马兰教授与裴钢院士领导的研究人员所采用的研究手段主要是几个方面，包括Immunofluorescence Microscopy（免疫荧光芯片分析）、Western Blotting、Intracerebroventricular Injection（脑内室注射）、Reverse Transcription Quantitative Real-Time PCR和Chromatin Immunoprecipitation（染色质免疫沉淀分析，ChIP）。

1. Immunofluorescence Microscopy
免疫荧光分析(Immunofluorescence assay，IFA)始创于40年代初，1942年Coons等多次报道用异硫氰酸荧光素标记抗体检查小鼠组织切片中的可溶性肺炎球菌多糖抗原，但由于此种荧光素标记物的性能较差未能推广使用。直至50年代末期，Riggs等(1958)合成性能较为优良的异硫氰酸荧光素，而Mashall等(1958)对荧光抗体的标记方法又进行改进，从而使免疫荧光技术逐渐推广应用。荧光色素（染料）有许多种，像FITE（异硫氰酸荧光素）、DAPI（4，6-联脒-2-苯基吲哚）、四乙基罗达明（RB200）等。在这篇文章中利用的是与抗小鼠IgG交联的德克萨斯红（Texas Red，发光红），这种染料是这些色素中波长最长的染料之一（600-660nm，为红色）。这种近红外荧光检测相对于其它方法具有低背景、高灵敏度的优点（一般的可见光荧光染料由于NC膜，PVDF膜等的高背景，荧光不能有效的用于膜上蛋白与核酸的直接荧光成像），而且另外一个优点——宽广的线性范围也使得强信号与弱信号能够同时被识别。

2. Western Blotting
蛋白印迹显色系统这里使用的是化学发光法（Chemiluminescent），其原理见生物通技术文章（Western Blot显色篇：八仙过海，各“显”神通（上））。而检测手段上研究人员利用的是先进的来自LI-COR Bioscience的Odyssey Infrared Imaging System，这种低背景，信噪比好的检测系统据说极大的帮助了这一研究成果的发现——Odyssey不需要信号放大步骤，强弱带可以同时呈现在同一图像上，双色检测（用标记不同的红外荧光染料的二抗或者探针可以对一张膜的两个目的蛋白或核酸进行同分析）。

3. Reverse Transcription Quantitative Real-Time PCR
逆转录定量PCR（qRT-PCR），是一种应用广泛的研究基因表达模式的方法，尤其是在样品量少或者说非常珍贵的时候。这种方法主要的优点是范围宽、敏感性高、精确度高，无PCR后处理步骤，避免了交叉污染，且产出率高，可以进行多重检测等。

4. Chromatin Immunoprecipitation
染色质免疫沉淀分析（ChIP）是一种在体内研究DNA-蛋白质相互作用的理想方法，相对于传统的其它研究蛋白与DNA相互作用的方法（比如EMSA， electrophoretic mobility shift assay），ChIP技术能更加真实、完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白，是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的最好方法。

而在这篇文章中就是利用的是ChIP技术和芯片技术的相结合（来自Upstate公司的ChIP assay kit），这有利于确定全基因组范围内染色体蛋白的分布模式以及组蛋白修饰情况，还可以用于组蛋白修饰研究、转录调控分析、药物开发研究、有丝分裂研究、DNA损伤和凋亡分析等方面。
（生物通记者：张迪）