直击蛋白质组学研究技术全过程[创新技巧]

【字体: 时间:2005年12月09日 来源:生物通

编辑推荐:

  

  缘起:2001年2月15日的Nature周刊在发布人类基因组框架图的同时也登载了一条关于人类蛋白质组研究组织(Human Proteome Organization,HUPO)成立的小新闻,标题就叫做——And now for the proteome. . .

    即日起,生物通开始的蛋白质组专题将以丰富多样的形式介绍蛋白质组研究的一些有力工具,有技术介绍,技术有声讲座,以及专门的产品介绍和疑难解答,BBS讨论,技术探密......

    确实,在人类基因组计划基本完成之后,科学家们越来越发现之前所认为的把各种生物基因组的全部碱基测序出来,就可以揭示和解释各种生命的遗传奥妙的想法太过于天真了。这是因为基因组计划所获得的遗传信息并不会直接参与生命活动,而是通过控制蛋白质的形成间接地指导有机体的新陈代谢。也就是说,一个基因所含的遗传信息,通过一系列复杂的反应,最终导致了相应的蛋白质形成,蛋白质再参与到生命的各种活动中去。所以,要想真正揭开遗传的奥秘,仅仅了解基因组的碱基排列顺序是很不够的,还必须认识基因的产物——蛋白质。

    但是不同于基因组是由DNA——只含有4种碱基的简单线性分子组成,蛋白质是一种由20种氨基酸的不同成分组成的复杂结构,而且更重要是由于不存在度量修饰蛋白质种类的尺度,人们也许永远不能像确定基因组核苷酸序列那样,准确地统计出生物体内蛋白质组的蛋白质总数,更别提各种蛋白修饰手段。因此在这个后基因组时代,这个蛋白质组研究时代,科学家们面临着更多的挑战。

    当然,即使是困难如蛋白质组研究,许多国家与研究院都已经展开了一系列研究:2002年美国实施了“临床蛋白质组学计划”;米里亚德遗传学研究所、甲骨文公司和日本日立公司已经组成联盟,计划在3年内完成人体所有蛋白质的图谱。一些生物技术公司也抓紧了这个机会,推出了许多相关的仪器和实验试剂,并且已经形成了一整套的技术平台。

一、 蛋白组研究流程

 

    从这张基本流程图上,我们可以看出实际上深入的蛋白质组学研究需要两条互补的实验工作流程——基于凝胶的工作流程(Gel-based workflow)和基于液相色谱的工作流程(LC-based workflow)。

    在这两种流程中,基于凝胶的工作流程是目前使用的较为广泛的、发展最为成熟的工作流程,通过样品制备、样品标记、双向电泳分离、图像获取、图像分析,到抠点、酶切、点靶和MALDI—TOF蛋白鉴定等一整套技术手段下来,如果还加上操作自动化,研究人员可以很方便的获得蛋白性质数据。而基于液相色谱的工作流程则可以对在双向电泳中难以分离鉴定的高分子量、低分子量、极酸性、极碱性和疏水性强的蛋白进行有效的分离鉴定。这两种方法结合起来可以对复杂样品进行预分离、对低丰度蛋白进行富集,还可以完成蛋白酶解后多维液相分离(MDLC)。选择那种方法来分析,需要研究人员根据不同的蛋白特性、样品种类以及研究方向和经费自己来选择一种工作流程展开研究。

二、 基于凝胶的技术平台
    在基于凝胶的技术平台分析中,2D-MS(二维电泳)这一步骤完成的好坏有决定性的作用。而在这一方面有一些像是在蛋白质中占很大比例的低丰度蛋白质不能被检出;分离跨膜蛋白困难;电泳分离不完全以及可信度等还是存在问题。为能较好的解决这些问题,蛋白电泳的鼻祖——GE(原Amersham)公司从样品制备,样品标记、双向电泳分离、图像获取、图像分析,到抠点、酶切、点靶等都提供了相应的产品,也很好的解决了部分问题。

1.样品制备与优化
    要想得到可靠准确的结果的前提是要有一个良好的开始。这一个良好开始的关键就是样品制备,要知道,在一开始样品制备中就丢失了的重要蛋白是永远不可能在后面的实验中弥补的回来的。

制备原则:

  1. 应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态(包括多数疏水性蛋白),且制备方法应具有可重现性。

  2. 防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。

  3. 防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰(如酶性或化学性降解等)。

  4. 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。

  5. 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白,从而保证待研究蛋白的可检测性。

Ø 破碎样品
    样品制备的第一步当然是细胞或者其它样品的破碎,这一步看似简单,但是操作中一旦方法不当,就又可能会丢失样品中的蛋白和导致蛋白被修饰。在实验室中经常会使用到的方法是循环冻融法和超声波法(破碎细胞),液氮研磨法和机械匀浆法(破碎组织),其中循环冻融法比较适合于提取培养细胞的稳定蛋白,而机械匀浆法是机体软组织破碎最常用的方法之一。但是这些方法都存在着一些“内伤”,比如前两个方法,特别是超声波法很有可能会由于强度掌握不当而造成蛋白降解,而在匀浆法中需要的离心步骤也有可能会造成大量的蛋白损失。

    为了保证蛋白的完整性,GE所提供的Ettan样品研磨试剂盒采用了专门设计的研磨颗粒在1.5ml的微型离心管中快速完成研磨并直接回收样品,每个试管可以在几分钟内处理100mg的样品,获得高回收率的蛋白,为研究者的第一步提供了“原材料”的保证。

Ø 纯化
    一般而言,在破碎样品获得蛋白之后常常需要通过蛋白沉淀去除干扰物质和浓缩样品,但是普通沉淀方法有时会由于沉淀不完全而造成蛋白丢失,而且得到的蛋白常难以重新溶解,因此一些厂家会推出一些针对这一问题的试剂盒,比如GE的Ettan 2-D Clean-Up试剂盒等都能较好的解决蛋白纯化问题。

    除此之外,由于一些样品,比如说人血清要进行双向电泳往往比较困难,这是因为血清中包含了数千个蛋白,浓度变化至少有9个数量级,而其中白蛋白占了总蛋白的50%-70%,IgG占了10%-25%,这两种蛋白常常会阻碍到其它蛋白的分离,限制了样品的上样量,在加上这两种蛋白的等电点范围较大会掩盖其它相似等电点分子量的重要蛋白,所以要在电泳之前进行一定的纯化。针对这一点,GE特别推出了Ettan去除白蛋白和IgG试剂盒,利用高特异性结合树脂去除这两种蛋白,获得高分辨率的蛋白。

Ø 定量 
    在纯化和浓缩了蛋白样品之后,许多研究人员就会直接进行电泳了,但实际上还有一个重要的步骤不容忽视,那就是定量,这对于蛋白表大量的研究尤为重要。目前一般定量方法都会采用试剂盒,这可能是由于常规方法的缓冲液中化学元素会影响定量以及价格方面的因素。


2.第一向电泳
    有一个很好的第一向聚焦(IEF)电泳分离才有可能使蛋白斑点在第二向电泳中分离的很清晰,尤其是当蛋白上样量很大的时候。这也可能就是为什么有人称第一向电泳“没有最高分辨率,只有更高分辨率”的原因了。

原理:
    等电聚胶电泳(IFE):利用一种特殊的缓冲液(两性电解质)在聚丙烯酰氨凝胶制造一个pH梯度,电泳时,每种蛋白质迁移到它的等电点(pI)处,即梯度足的某一pH时,就不再带有净的正或负电荷了。

    这种60年代建立起来的蛋白质电泳分离技术,无论是载体两性电解质,还是固相pH梯度技术,其基本原理都是利用蛋白质分子或其它两性分子的等电点的不同,在一个稳定、连续和线性的pH梯度中进行分离和分析。经过四代的更新发展,目前成熟使用的是第四代可作为双向电泳第一向的“杂交等电聚焦”。

    双向电泳(two-dimensional electrophorese):等电聚胶电泳和SDS-PAGE的组合,即先进行等电聚胶电泳(按照pI)分离,然后再进行SDS-PAGE(按照分子大小分离)(一般的双向电泳的次序),经染色得到的电泳图是二维分布的蛋白质图。
双向凝胶电泳技术是基于蛋白质两个独立的特性:等电点和分子量,双向电泳能够有效地分离一个复杂生物混合物中的蛋白质,分辨出成千上万个蛋白质。双向电泳的第一向分离可以通过蛋白质样品在固定pH梯度胶条(immobilized pH gradient strip)再水化和随后在电场作用下电泳而达到。带电荷的蛋白质在pH梯度范围内移动,直到达到了它们的等电点位置,此时它们所带的静电荷为零,因此就停止移动。也可以使用非平衡pH梯度电泳。


流程:



仪器设备:
    在这一方面,当然是GE相应的电泳控件当仁不让了,其Ettan IPGphor是一个完全一体化的电泳系统,可以快速、简便和高重复性的进行聚焦电泳。





3.第二向电泳
    在第一向等电聚焦完成后,IPG胶条被放置在均一或梯度SDS-PAGE(sodiumdodecyl sulfate polyacrylamide gel) 凝胶的阴极端,在胶条的一边或两边可以加入标准蛋白质作为分子量标记物。在电场的作用下,带负电的SDS-蛋白复合物根据它们的大小以不同的速度朝着阳极移动。小分子蛋白质移动得更快,更远;大分子蛋白质移动得更慢,走过的距离也更短。

    最后,凝胶上的蛋白点可以通过放射性标记或各种染色方法染色而观察到,这些染色方法包括银染、考马斯亮兰或荧光染色。一般而言,如果之后要进行质谱检测,则应该采用考马斯亮蓝染色,但这种方法灵敏度不高;如果目标蛋白是低丰度蛋白,则应该采用银染法;如果要提到灵敏度,那么放射自显影和荧光成像就是首选了,这两种方法可以检测低至200fg。所得到的合适的图像扫描装置扫描凝胶后可产生数字图像,这些数字图像可以使用双向凝胶图像分析软件,如ImageMaster进行分析。
讲到这里就不得不提到GE公司在双向电泳技术的基础上发展出的新Ettan DIGE蛋白表达差异分析技术。这种技术在传统双向电泳技术的基础上,结合了多重荧光分析的方法,在同一块胶上可同时分离多个由不同荧光标记的样品,而且更重要的是Ettan DIGE第一次引入了内标的概念,也是目前唯一用内标来衡量每一块胶上每一个点的系统,由于每个蛋白点都有它自己的内标,并且软件全自动根据每个蛋白点的内标对其表达量进行校准,保证所检测到的蛋白丰度变化是真实的,这样极大的提高了结果的准确性、可靠性和重复性。除此之外,在灵敏度方面,Ettan DIGE可对微量(少到5μg)样本进行蛋白质组学分析,也可以检测到样品间小于10%的蛋白表达差异,统计学可信度达到95%以上。

4. 蛋白斑点后续分析
    在染色之后,如果需要对图像分析后感兴趣的蛋白质进一步分析,那么首先就要将这些蛋白斑点用人工或者自动化仪器提取,然后进行酶解。现在有4种酶解方法将蛋白切成肽段:①凝胶内酶切(in gel Digestion);②电洗脱后在溶液中酶切(electrotransfer and digestion in solution);③电转移到膜上后在膜上酶切(electrotransfer onto a membrane and cleavage on the membrane);④在印迹过程中酶切(digestion during blotting)。

三、基于液相色谱的工作流程
    由于基于凝胶的蛋白质组学分析对于低丰度蛋白质以及跨膜蛋白分离获得困难,还有电泳分离可能不完全等原因,因此在完成了凝胶分析之后,一些研究人员会进行液相色谱的分析。其主要步骤包括通过凝胶或者色谱纯化获得完整蛋白,酶切得到肽混合物,然后利用质谱测定肽质量以及选择肽段裂解。这些步骤自动化水平一般都较高,且看生物通后续介绍。
(生物通:张迪)

订阅生物通快讯

订阅快讯:

最新文章

限时促销

会展信息

关注订阅号/掌握最新资讯

今日动态 | 人才市场 | 新技术专栏 | 中国科学人 | 仪器云展台 | 实验云展厅 | 云讲堂直播 | 会展中心 | 特价专栏 | 免费试用 | 有奖调研

版权所有 生物通

Copyright© eBiotrade.com, All Rights Reserved

联系信箱:

粤ICP备09063491号