生物通技术专评：质粒纯化是分子生物学实验的最基础的技术，虽然手工提取质粒技术并不复杂，但是到今天越来越多实验人员选择质粒纯化试剂盒，务求更快、更简便、更稳定可靠地纯化质粒，让实验人员有更多的时间思考和研究；今天实验室人员自我保护意识不断增强，使用试剂盒避免用有毒且污染环境的有机试剂，能更好地保护实验人员的安全。市面上品牌众多品种更多，如何挑选适合自己需要的纯化产品？生物通带大家畅游质粒纯化之旅，让大家一览顶级品牌好在哪里，谁更经济，性价比如何,国产品牌如何……

首站：Qiagen篇

    Qiagen是世界各地研究人员公认的最好的核酸纯化品牌之一。良好的口碑、稳定可靠的质量，每年40％的强劲增长支持Qiagen强大的科研力量专注于核酸纯化技术的不断改革和创新，使得Qiagen的产品系列广泛而全面，更成为众多小品牌模仿和学习的目标。就如IBM笔记本电脑一样，Qiagen奉行优质优价的政策，再加上关税运费等因素，使得Qiagen在国内市场中成为“高端产品”的代名词。常有实验室的人说，如果是一般实验就用国产的，如果是重要实验就用Qiagen的。诚实的说，质量和价格一向都是成正比的，所以这样一个顶级品牌到底在哪里还是值得我们去了解的。

    就质粒纯化领域来说，作为用户，提质粒关心的不外乎这几个因素：
1． 获得产物的纯度，因为所得质粒纯度和下游应用密切相关。
2． 产量/得率，根据个人需要获得产物的量来选择不同的纯化量。
3． 速度和使用的方便程度，稳定性。使用试剂盒无非是为了快速方便和稳定。
4． 经济性

  Qiagen的质粒纯化产品线充分照顾了4种不同纯度级别的需要（向下兼容）：
1． 高级转染级――这种最高纯度的去内毒素的质粒纯化，适用于基因治疗、细胞显微注射、DNA疫苗、基因沉默(RNAi)等要求严格的操作，以及转染原代细胞、敏感细胞、悬浮细胞等对内毒素特别敏感的细胞株。
2． 常规转染级――这种纯度优于2次CsCl超速离心纯化的质粒，适用于多数细胞的转染实验、特殊的修饰反应、BAC或者cosmid建库等实验
3． 分子生物学级――这种纯度相当于1次CsCl超速离心纯化的质粒，适用于常规的建库和克隆实验、部分细胞转染、体外转录和体外翻译实验
4． 测序级――最经济的初级纯化标准更适合于常规酶切连接反应、高通量测序、PCR、探针合成、转化等常规实验

    就纯化规模来说Qiagen的产品简单可分为Mini(20ug), Midi(100ug-200ug)，Maxi(500ug-750ug)，Mega(2.5mg)，Giga(10mg)，甚至更高的100mg大规模纯化。此外Qiagen还提供包括96孔板、8条管等高通量Mini纯化试剂盒。作为看家产品之一，Qiagen的质粒纯化产品得率是很高而且也很稳定的，一向都是质量的保证，不然也不会得到大家的一致认可。曾经某人很骄傲地告诉生物通：基本上，投诉Qiagen产品的最终发现都是用户自己的使用问题。Qiagen对自己的产品极为自信－－最严格的质量控制，加上全球科研人员的一致认可，你做不出来多半是自己的问题。当然Qiagen也在不断改进说明书，甚至考虑提供中文版以减少误会的发生。

    除了质量的稳定可靠之外，Qiagen的产品设计非常人性化，不断改进以便充分满足了越来越高的要求－－更快，更方便。比如需要大量纯化超纯质粒时，经过溶液1，2，3处理后需要大容量高速离心机离心沉淀。Qiafilter的推出可以经过抽滤漏斗的形式快速抽滤，避免这一次较长时间的离心，而且过滤得更干净－－连偶尔出现悬浮在离心上清的细胞膜沉淀也可以彻底去除，令后面的纯化更有效率。另外离心或者抽滤得到的上清都需要经过Qiagen重力离子交换柱，在低盐和重力的作用下溶液流过交换树脂，复性的质粒不断被树脂吸附，杂质随溶液流出。专利的纯化树脂可以在不用酚氯仿等有机试剂的条件下极高效的纯化质粒，但是制备质粒的规模越大，溶液越多，上柱的时间也越长。最后用高盐洗脱的质粒还需要经过异丙醇沉淀。为解决时间太长的问题，Qiagen推出了HiSpeed系列，离心或者抽滤得到的上清通过一个针管过滤器，质粒就可以高效地吸附在过滤器里的纯化介质上，最后很方便的洗脱。只需要20分钟－半小时就可以完成原来需要2个多小时的过柱工作，而且不再需要大容量高速冷冻离心机了。对于没有大离心机的实验室真是很方便的。对于一些需要做BAC，粘粒等超大质粒纯化的用户来说，基因组片断的污染和难以区分是一件烦人的事－－Large Construct Kit就可以借助ATP依赖的DNA酶来消化线性的DNA而保留环状质粒，彻底去除基因组片断的污染。

    Qiagen的产品设计的细心和严谨可靠确实值得称道。特别是对于有特殊高要求的用户来说，Qiagen的质量是对得起这个价格的，每年两次的特价活动也算不错的入货机会。我们在这里简单介绍一下Qiagen质粒纯化产品

1 高级转染级

    当你提取DNA是为了转染原代、敏感或者悬浮的细胞；进行基因沉默研究、细胞注射显微操作；进行基因治疗或者DNA疫苗等要求极为严格的实验，就应该考虑选择以上两种试剂盒。EndoFree系列是为了除去细菌中的内毒素而专门设计的。内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁上特有的成分，它主要成分是脂多糖中的类脂A。它在细菌被裂解时被释放出来，它的存在会极大程度地影响转染效率。同时内毒素可以激活免疫细胞的非特异反应，造成实验中的假阳性。

    EndoFree系列设计有特殊的Endotoxin removal buffer有效去除内毒素，使用此试剂盒提取的DNA内毒素含量小于0.1 EU/μg；同时引用了Qiagen独家专利的QIAfilter的超纯过滤技术，使得到的DNA纯度相当于两次氯化铯超速离心分离纯化，而避免了常时间超离。试剂盒操作方便、快捷、结果稳定可靠；可以分别选取500ug、2.5mg、10mg的不同纯化量。当提取低拷贝质粒时建议使用mega级试剂盒而不是giga级，原因是在过滤大量的细菌培养液时QIAfilter的过滤容量有限。
当你所需DNA用量十分巨大时，比如说DNA疫苗免疫动物，可以考虑使用Qiagen公司专门为纯化核酸设计的采用了阴离子交换技术的Ultrapure 100 column。

    提取超纯DNA时无需使用常规提取中有毒的化学试剂，如苯酚、氯仿、溴化乙啶、氯化铯等，将有害物质减小到最少，从而更好的保护实验操作人员的自身安全。

2 常规转染级 

    当你进行普通转染、构建文库、对DNA进行修饰时可以考虑以上几种试剂盒。当你用量较小时，可以考虑Plasmid Mini Kit和QIAwell 96 Ultra系列，其中QIAwell 96 Ultra系列采用8孔条或96孔板进行提取，可以利用机器人工作台进行机械提取，重复性较好。用量较大时可以选用HiSpeed Plasmid和QIAGEN Plasmid/QIAfilter/Large Construct系列。Large Construct系列是专门为了大型质粒设计的，它采用独特的ATP依赖核酸内切酶有选择地消化了细菌的基因组DNA，使结果更加可靠。除了这种专门为大型DNA设计的试剂盒外，还有QIAwell 96 Ultra、HiSpeed Plasmid和QIAfilter系列也可以提取大至50kb的质粒。

    如果你有许多质粒要提取，那么可以采用QIAfilter系列以节省你的时间。此系列采用阴离子交换柱进行纯化。中性的细菌裂解液直接装入QIAfilter Cartridge中，在数秒内过滤除去杂质，将滤液装入到阴离子交换装置中，在低盐、合适的pH值下质粒被选择性的结合上去。利用中等盐浓度的洗液去除RNA、蛋白、代谢物及其它低分子量杂质。用高盐溶液将DNA洗脱，洗脱液用异丙醇沉淀，离心收集产物。

    如果你不需要很高的产率只是要求进一步提高速度，那么HiSpeed Plasmid系列将是你不二的选择。它的改进之处是在QIAfilter系列基础上，将过柱和离心操作改为用注射器收集产物，这样大大加快了提取的速度，将整个提取过程缩短到45或65分钟。HiSpeed Midi系列纯化载量是200ug，比原来的100ug大一倍，而HiSpeed Maxi的载量更高达750ug，比常规Maxi能纯化更多的质粒。

3.分子生物学级

    相信在大多时候，你提取质粒就是进行分子生物学操作，如体外转录/翻译，PCR，酶切等。在这个级别有两个系列以供选择。这两个系列都可以提取大至50kb的质粒。QIAprep Spin则是采用应用最广泛的硅胶膜技术，用高盐溶液离心过柱使DNA吸附，用低盐溶液离心洗脱。得到的质粒相当于一次CsCl超速离心纯化得到的纯度，适合转染生命力较强的细胞，体外转录/翻译，长程测序，当然也包括常规的酶切，PCR等等。实际上这个纯度非常高，一些常用细胞株的转染也可以胜任；而酶切连接PCR这些实验只需要载测序级纯度的质粒就足够了，用不着这么高纯度。国产许多品牌都主战于这个范围，普通产品也能够满足一般酶切PCR等反应需要，因而个人以为这里Qiagen实在没有什么优势。生物通会在随后介绍更为经济实惠的国产篇。

    TurboFilter96孔板设计有非均匀的过滤装置，在高盐溶液下TurboFilter96孔板直接真空过滤细菌裂解液。除去大颗粒的滤液再经转染生命力较强的细胞，体外转录/翻译，长程测序过QIAprep 96孔板进行下一步的纯化。此法需时少，而且重复性好。

4.测序级

    在人类基因组项目完成后，相继有许多其它物种的基因组全序列被测出，这些都离不开测序技术的改进。以上三个系列都是为了高通量测序而设计的，它们在提取时都十分快捷、方便。DirectPrep 96 和MagAttract 96系列可以提取大至50kb的质粒，其中DirectPrep 96系列设计的裂解方式省略了清除裂解液这个步骤；而MagAttract 96系列采用的是磁珠技术，降低了试剂盒的成本。R.E.A.L. Prep 96系列采用的是快速碱裂解系统，除了一般的质粒，还可以提取cosmids, BACs, PACs, 和P1s等大型的载体。不过这个级别Qiagen没有提供手工提取的试剂盒。其实我们不就要又便宜又快的东西嘛。

    Qiagen公司质粒提取试剂盒产品可以说是十分齐全的，相信无论你有什么样的需求都可以找到一款适合自己的产品。不过，质粒纯化当然并非只此一家，每个品牌自有自己的立足的理由。生物通将随后介绍来自Invitrogen，Roche，Promega，Stratagene等著名品牌的质粒纯化系列报道，当然也将包括比较知名的国产品牌的介绍。（生物通作者：谢菲 吴青）