聚焦转染:8大品牌转染试剂强中强[选购宝典]

【字体: 时间:2005年07月26日 来源:生物通

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生物通技术专评:数百万年来原核生物如大肠杆菌就经常相互分享它们的遗传物质的——受到自然的启发,出现了将DNA导入哺乳动物培养细胞的技术——这是分子生物学的又一个重要的里程碑。也多谢这种技术的不断进步,我们终于可以在各种哺乳动物细胞中进行各种克隆化基因的表达,从而达到不同的目的--比如,生产制备大量经过真核特有的翻译后加工的活性蛋白;研究表达蛋白的结构和生化特性;研究基因表达的调控机理;甚至调控基因的表达等等。可以说在哺乳动物细胞中表达外源基因的2个关键:一个是选择构建合适的表达载体和表达细胞株,另一个就是选择合适的方法将克隆的基因导入培养细胞中进行表达。

    转染技术的广泛使用促进了人们对外源基因在哺乳动物细胞中的表达等方面的认识,并在方法学上促进了该领域及相关领域的发展。从磷酸钙到脂质体,到多胺,可用于转染的细胞种类已越来越多,转染试剂也不断更新换代,而转染也不再仅限于将DNA转入细胞中了,RNA,siRNA,蛋白质等等生物大分子也进入了转染的行列。在纷纭的产品中,你会选择哪种转染试剂?生物通这个转染试剂专辑希望为大家介绍市面上主流的转染试剂和各自的个性特点和适用范围--可以说,针对不同的细胞株,不同的转染实验目的,还有不同的转染要求,很难找到一种能满足所有的要求,十全十美的产品。你需要一一尝试和优化条件——但是了解市面上各种产品的特点与长短,无论是对于转染新手,或者是“老革命遇到新问题”,都是有益的。在生物通这个转染试剂专辑系列我们将分别介绍国外几个经典好用的王牌产品,以及国内物美价廉的后起之秀,以及总结一些使用心得和注意事项。如果你有自己的心得并愿意和大家分享,欢迎投稿生物通哦:)

一、打开转染之门:基本概念
    作为篇首还是要把老调调再弹弹。请原谅我有点“唐僧”的回顾几种经典转染方法。
DEAE-葡聚糖(Diethylaminoethyl (DEAE)-dextran):这个早在1965年出现的转染方法差不多是最古董级的方法之一了,直到现在竟然还有少数人坚持采用。带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体可以结合带负电的DNA分子,使得DNA复合物结合在带负电的细胞表面。通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克,也可能是细胞内吞作用,使得DNA复合体进入细胞。DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染,可重复性好,转染时要除掉血清。

磷酸钙共沉淀转染:最早是在1973年开始采用的。氯化钙+DNA+磷酸缓冲液按一定的比例混合,形成的极微小的磷酸钙-DNA复合物沉淀粘附到细胞膜表面,借助内吞作用进入细胞质。沉淀颗粒的大小和质量对于转染的成功至关重要,pH值,钙离子浓度,DNA浓度,沉淀反应时间,细胞孵育时间乃至各组分加入顺序和混合的方式都可能对结果产生影响,重复性不佳。现在还会操作这种古董级方法的人怕已经不多啦。比起DEAE法这个更容易得到稳定转染,但是转原代细胞比较困难的。

电穿孔法:通过短暂的高场强电脉冲处理细胞,沿细胞膜的电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。DNA被认为是穿过孔扩散到细胞内。电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要,因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。理论上说电穿孔法可用于各种细胞,而且不需要另外采购特殊试剂。可是需要昂贵的设备——这个一次性投资可不便宜,而且每次转染需要更多的细胞和DNA——因为细胞死亡率高。每种细胞电转的条件都需要进行多次优化。

脂质体:中性脂质(lipid)是利用脂质膜包裹DNA,借助脂质膜将DNA导入细胞膜内。带正电阳离子脂质体(Cationic liposomes)则不同,DNA并没有预先包埋在脂质体中,而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上,形成DNA-阳离子脂质体复合物,据认为一个约5kb的质粒会结合2-4个阳离子脂质体,从而吸附到带负电的细胞膜表面,经过内吞被导入培养的细胞。脂质体转染方法始于1987年,这个方法的出现使得转染效率、转染的稳定性和可重复性大大提高,并广为使用。阳离子脂质体细胞毒性相对较高,对不同的细胞可能会干扰细胞的代谢。血清的存在有可能会影响转染效率,需要进行优化。通常转染试剂有不同脂质(lipid)和脂质体(liposome)混合配方。

非脂质体的脂质(Non-liposomal lipids):这个读着颇为拗口的新一代技术,代表着脂质体技术的未来发展方向——革新配方成分形成胶束(micellar)结构而非简单的双层膜结构,令核酸传递更有效率而且细胞毒性也显著降低。

活化的树状聚合物(Activated dendrimers)这个确乎是Qiagen的独门配方的Activated dendrimers本来真正属于纳米技术,高度树状分枝形成球形结构有着均一的大小和形状,借助每个球体无数活化的氨基末端凝聚在DNA上形成较为致密的结构,并吸附在细胞膜上,经过内吞进入细胞。活化的氨基可以调节胞内融酶体的pH值,抑制降解活性,使得DNA稳定存在。转染的效率高,毒性低,可重复性好。血清的存在能显著提高转染效率。

多胺和新一代转染介质:多胺其实也是氨基多聚物,原理无非基于吸附带负电的核酸形成非共价结合的复合物,结合并穿越同样带负电的细胞膜。优点是可以携带较大的分子,而且细胞毒性也较低,不会干扰细胞代谢途径。新一代转染介质并不局限于单一成分,各种不同专利配方的脂质、加上蛋白质组分、以及各种各样的专利成分,务求令转染效率更高,操作更方便,细胞毒性更低。还有的产品将脂质偶联到细胞膜特定受体蛋白的配基上,让受体蛋白更有效率地转运DNA或者生物大分子复合物进入细胞......

显微注射和基因枪(Biolistic particle delivery):
    技术总是在不断进步,显微注射和基因枪是更特殊的导入DNA的方式:将DNA沉淀包被在极为微小的金颗粒(闪闪发光的金珠,gold beads)上,借助高压基因枪将大分子直接“射”入细胞,一旦细胞接受,就会发生瞬时表达——这种方法多用于活体内导入DNA,比如皮肤的DNA免疫。也有用于上皮细胞原代细胞的报告。最新技术是利用硅纳米颗粒作为基因转染载体。

    显微注射顾名思义就是使用一根超细针头将DNA,RNA或蛋白直接注入细胞质或细胞核;整合的机会高一些,但适用这种方法的细胞好像不多,体外受精较为常见。这两种方法需要的昂贵设备和相对复杂的技术,令普通实验室敬而远之。

病毒介导的感染
    荷马史诗对整个欧美文化的影响内在而深远的。受荷马史诗中的特洛依木马的启发,借助病毒高效感染细胞的机制,将病毒衣壳内的核酸换成克隆的目的基因,就可以将目的基因高效运送到特定的细胞中——整一出“木马计”。感染,是区别于常规转染的另一种将外源基因导入哺乳动物细胞的方法。前面提到的转染是利用某种生化试剂或者物理介质“携带”DNA穿过细胞膜进入细胞,这种相对简单的方法适用于绝大多数培养细胞。感染需要将目的基因克隆到特定的病毒体系中,经过包装细胞的包装得到“经过改造的”病毒,再进行感染--优点是感染效率特别高,特别是有些难以转染的原代细胞、活体细胞。适用的细胞类型与病毒感染特性有关,常用的病毒体系包括逆转录病毒,可以高效将目的基因整合到染色体上而得到稳定表达,但只适合处于分裂期的细胞,能装载的核酸大小有限;腺病毒可以感染分裂期和非分裂期的细胞,但是不能整合稳定表达,只是游离地瞬时表达;痘病毒能装载大片断DNA又能感染大多数哺乳动物细胞,可是仅限于瞬时表达;杆状病毒受限于只能感染昆虫细胞。总的来说,病毒体系时间长代价高也比较复杂,操作不当还可能有潜在的危险:( 。这个木马可不那么好骑滴。

补充一点:转染类型: 根据不同的实验目的,外源DNA导入哺乳动物细胞又可分为瞬时转染和稳定转染。瞬时转染一般是指外源基因进入受体细胞后,存在于游离的载体上,不整合到染色体,在外源DNA导入细胞1—4天后收获转染细胞对转染基因的转录和复制进行分析。而稳定转染则需要使外源基因整合于细胞染色体从而得到稳定的转染细胞株。除DEAE葡聚糖只能用于瞬时转染,其他方法均可用于瞬时转染和稳定转染。

二、 转染条件的优化(先介绍有哪些好东西吧,这个老生常谈的优化问题请参考生物通聚焦转染系列的终结篇吧)

生物通作者:张迪 吴青

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