创新,令技术更人性化:质粒纯化之Promega篇[选购宝典]

【字体: 时间:2005年07月08日 来源:生物通

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生物通技术专评:由William Linton 先生在1978年创建的美国普洛麦格公司 (Promega Corporation),总部位于位于美国威斯康辛州麦迪逊市。Promega 公司的产品最初集中于分子生物学研究领域,现在已扩展至细胞生物学、神经生物学、遗传鉴定等众多生命科学和生物技术制药范围。目前,公司年销售额达1亿多美金。1985年Promega在中国河南洛阳市与中国国际信托投资公司和洛阳春都集团成立了中国第一家生物工程合资企业—华美生物工程有限公司(SABC)。1992年在中国上海市与中国科学院上海生物工程研究中心创建上海普洛麦格生物制品有限公司(SP)。1998年又在北京成立了普洛麦格公司北京办事处。

    Promega作为最早进入中国市场的著名品牌之一,价格相对其他进口品牌来说算是比较可亲的。其质粒提取系列的试剂盒划分比较简单,就是测序级别和转染级别。质粒纯化产品所采用材料主要分为三种:磁珠、硅胶和树脂。

    转染级别的PureYield Midiprep是最值得推荐的产品,因为一个字--快。快,源自于PureYield的设计巧妙――溶液123/重悬、变性和复性之后,常规试剂盒不是要离心或者Filter过滤去除沉淀吗?然后过滤的上清还要过柱让质粒吸附在纯化介质上,一般都是要经过两个步骤。而PureYield巧妙地将这两个步骤合而为一,将裂解复性液过滤柱和质粒DNA纯化柱上下组装起来,一步抽滤,溶解于溶液的质粒连同上清穿过第一级滤膜进入第二个纯化柱,质粒被吸附,上清穿过纯化柱被抽走。而沉淀就留在第一个过滤柱上。整个过程一气呵成,一步就完成了两步的工作,绝对巧妙,省时省事。这种纯化的质粒纯度和普通的快速离心法差不多,所以PureYield特别增加了专门去除内毒素的清洗步骤,使得得到的质粒足够常规的真核细胞转染。虽然这种方法得到的质粒纯度不如阴离子交换柱,但是对于常规转染来说,够用就好了,而且这个方法非常快速简单,不需要漫长的离心、也不需要异丙醇或者乙醇沉淀干燥之来的枯燥操作,30分钟OK,而且柱子的载量也高达200ug之多。如果是用于常规的细胞株转染,PureYield值得推荐的。(笔者早在2003年的生物通BBS中就有设想过这种设计,可惜一直未有机会实现,深以为撼。这是题外话了)

    另外一个转染级别的Wizard PureFection纯化系列采用的是磁式分离技术,就是利用吸附DNA的带磁性纯化填料在磁场中被吸附固定,便于清洗其他杂质。不过老实说,以笔者个人之见,磁式分离真正的王道是柱式过滤分离,而非现在这种用磁铁吸住管底磁珠的方法――用手抓着磁力架倒上清,怎么觉得好像有点傻。当然,如果是全自动操作就领当别论了。磁式分离还需要一块额外的磁铁分离器。不过Wizard PureFection还是有独到之处――专利的去内毒素树脂,在溶液123并离心后得到的上清里加入这种树脂可以有效吸附内毒素,而这种填料没有磁性,本身在磁场中不能被磁铁吸附,所以在清洗杂质的时候很容易被去除而不会影响结果,这样得到的质粒内毒素水平降到最低而可用于常规的真核细胞转染。此外由于Wizard PureFection的磁性纯化颗粒是后来加入上清的,可以根据纯化质粒的多少加入不同的量,因此Wizard PureFection也就有无可比拟的灵活性――无论是中等规模或者大规模都可以胜任,你就不需要担心-一“我需要多提一些或者少提一些怎么办?”

    测序级别的质粒纯化选择相比较为丰富,有基于硅膜技术的快速离心Wizard Plus SV Miniprep,也有基于树脂填料技术的比较灵活的Wizard Plus系列。两个系列的区别在于这个SV是固定载量的硅膜技术,不需要另外加纯化树脂,采用快速离心方式,方便快速,但不如后者灵活。使用该系统可从1-10ml过夜培养的大肠杆菌培养液中纯化质粒DNA。纯化的质粒DNA可直接用于BigDye®终止法自动化荧光测序及其它分子生物学应用。也可补加核酸酶抑制剂后用于体外转录反应。
Wizard Plus系列的最大特色就是灵活性,可以通过加树脂的多少来调整每次纯化的量,能够满足多变的需求。Wizard Plus从Mini到Midi、Maxi、Mega等都有。以树脂为基础的系列试剂盒都可以采用真空抽滤的方式进行过滤,使用这个系统纯化质粒,仅需一个离心机、一个真空源及一个真空装置,操作方便、快捷。纯化的质粒不需进一步处理,可直接用于荧光测序和酶切,也可补加核酸酶抑制剂后用于体外转录反应。

    生物通网站根据用户使用时所关心的几个因素:所需时间、产率、用途(涉及到需要的浓度与纯度)对Promega的产品进行归类比较。 

 

特征

所需时间

产率

用途

以树脂为基础

 

 

 

 

Wizard® Plus Minipreps

小量质粒纯化,利用树脂

<45分钟

1-10μg

荧光测序/酶切消化/体外转录和突变

Wizard® Plus Midipreps

中量质粒纯化,利用树脂

<1.5小时

60-200 μg

Wizard® Plus Midipreps

大量质粒纯化,利用树脂

<3小时

300μg -1mg

Wizard® Plus Midipreps

超量质粒纯化,利用树脂

<3小时

>1mg

 在争分夺秒、信息规模在不断“提速”的今天,高通量快速质粒纯化已经日渐走入实验室,为高速发展的研究进一步加速。高通量的纯化产品逐渐成为各大厂家争夺的市场目标。老牌的Promega当然不例外。

 

特征

所需时间

产率

用途

以磁珠为基础

 

 

 

 

Wizard MagneSil TfxTM System

采用磁性技术高通量纯化直接用于转染及其它生物学实验的质粒

45分钟

最大产率8mg

96孔,转染级质粒

Wizard® MagniSilTM Plasmid Purification System

采用磁性技术进行96孔板质粒纯化

根据自动化系统不同而有所不同

6μg

荧光测序酶切消化

Wizard® PureFection

采用磁性技术进行质粒纯化

<2小时

<1mg

转染

Wizard MagneSil Tfx™ 系统可快速地从96孔板中纯化提取质粒DNA,方法简单、可靠。纯化的质粒可直接用于转染及其它分子生物学技术。该系统采用内毒素移除树脂,获得低内毒素水平的质粒DNA,与其它自动化的测序级质粒纯化系统相比,该系统对内毒素的清除率提高95%以上。采用Biomek® FX纯化96孔板细菌质粒可在45分钟内完成。

   Wizard® MagneSil™ 质粒纯化系统可从多孔培养板上快速纯化质粒DNA,操作方法简便、快速。纯化的质粒可直接用于自动荧光测序,如采用BigDye® 终止测序试剂,以及其他分子生物学技术操作,如限制性内切酶消化反应。

   使用MagneSil™ 磁性颗粒澄清裂解液(MagneSil™ BLUE)及俘获DNA (MagneSil™ RED),避免了离心和真空操作,从而使系统便于全部自动化操作。MagneSil™ 颗粒具有可放大性,适用于96孔板和384孔板操作。
 

 

特征

所需时间

产率

用途

以硅胶为基础

 

 

 

 

Wizard® SV 96

采用硅化膜进行96孔板质粒纯化,真空法

≤60分钟

1.5ml培养液提取3-5μg

荧光测序酶切消化

Wizard® Plus SV Minipreps

采用硅化膜利用离心或真空方法进行质粒纯化,真空法或离心法

<45分钟

1-20μg

荧光测序酶切消化突变和TNT®转录/翻译

PureYield™ Plasmid Midiprep System

抽滤柱

抽真空的提取模式

<30分钟

400μg

转染、体外表达以及其它分子生物学应用

Wizard® SV 96拥有独特的真空装置设计,消除了手工处理废物过程,并且裂解液澄清和DNA结合同时进行。新的平板设计避免了样品处理过程中的喷溅,防止了每个孔之间样品的误差。可在60分钟内从96个样品中纯化提取质粒。可选用手工或自动化模式进行质粒纯化。每批产品经检测可确保采用ABI 377 DNA测序仪,用BigDye® 终止测序法对pGEM ® -3Zf 载体DNA进行分析,可读取600个碱基,准确率超过98%  

生物通作者:谢菲 吴青

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