Cell封面文章:复旦发明创新重组技术!

【字体: 时间:2005年08月15日 来源:生物通

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生物通报道:
你是否看到8月12号发行的Cell杂志?封面是几只蓝色的老鼠。2005年8月12号这真是一个我们学术届值得庆祝的日子,世界顶级Cell杂志发表的第122期的杂志封面文章是由来自复旦大学生命科学院的学生作为第一作者的,他就是年仅26岁的丁昇。

图为这个课题的铁三角组合:组长许田博士(中)和吴晓晖博士(右)

与丁昇同学(图片来源:复旦大学)


文章的主要作者第一作者丁昇,与第一作者做同等贡献的第二作者吴晓晖博士,文章的通讯作者许田博士都是来自复旦大学生命科学学院。可以说这是今年继中科院上海神经所和生物物理所连发三篇Cell文章后的第四个令人振奋的消息,同时这也是对复旦百年校庆的最好学术献礼。
今天小编想跟大家介绍的是这项工作的意义,首先让我们先回忆一下整个基因重组的发展过程。
1953年,Watson和Crick发现了DNA的双螺旋结构,标志着分子生物学的诞生!后来人们发现了限制性内切酶,可以说这是人们第一次尝试对DNA进行操纵,因此产生了DNA重组技术。相信酶切、连接是大家应用最多的重组技术了,但是随着我们得到的信息越来越多,酶切的方式实在不够用了。你怎么能奢望一个基因组里就只有一个这种酶切位点,而且限制性内切酶在对付基因组DNA时实在有点心有余而力不足,切不动。
后来人们也发明了各式各样的遗传重组技术,我想按照教科书的介绍主要是有三种:同源重组,位点专一重组(又名特异重组)和转座作用。
同源重组我们应该是最熟悉的,从初中就在讲姐妹染色体的交换了。后来人们利用大肠杆菌中几个介导同源重组的蛋白,对一些外源DNA在大肠杆菌中进行大片段敲除或者替换。目前实验中应用较多的包括ET重组(这里ET可不是外星人的意思,它是两个蛋白产物的缩写)、RecA介导的同源重组(我们使用的工程菌株JM109、DH10B都是RecA缺陷的,它的突变可使大肠杆菌重组频率降低106倍)、单链DNA介导的同源重组等。
至于位点专一重组,Invitrogen公司已经有利用这一原理的系列产品。比如杆状病毒表达系统中的Bac-to-Bac,这里的Bac指的不是我们所说的细菌人工染色体(Bacteria Artificial Chromosome, BAC)而是一种穿梭载体Bacmid,它来源自杆状病毒(Baculovirus);还有Gateway系统中利用的λ噬菌体位点专一重组技术。
最后讲到的这个转座作用是由美国遗传学家巴巴拉.麦克林托克,她是看到一些玉米上面有颜色不同的斑点而开始研究的。后来她发现了转座作用,可是她发现这个原理四十年无人问津,她从一个姑娘等成一个老太婆才终于获得人们的认可,获得了诺贝尔奖。
以上的几种方法可以说实现了大片段DNA的操作,但是它们都是应用在细菌或者是昆虫细胞中的。人们以前也尝试利用转座作用对哺乳动物的基因组进行基因操作,但是一直没有找到一种稳定的、可以插入大片段的转座因子。RNAi可以说是对基因功能研究的另辟蹊径,人人都在关注DNA水平上的沉默,它从RNA水平上对基因功能进行抑制,也就是我们说的转录后抑制。现在RNA成为耀眼的明星时候,复旦大学的研究人员看准了方向,仍是把目光放在DNA水平抑制基因功能的研究,他们把注意力放到了一种来源自粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)的转座因子PiggyBac上。
PiggyBac(PB)转座子倒不是由复旦大学的研究人员最早发现的,它最初是在侵染昆虫细胞株的杆状病毒内首次分离得到的。在分类上属于真核生物的第二类转座子,是一个自主因子,长2 476 bp,有短的末端反向重复序列(ITR)和一个开放编码框(ORF),ITR长13 bp,ORF长2.1kb。PB转座子可以在基因组中切出和转座,切出和转座总是发生在特征性的TTAA 四核苷酸目标位点序列,转座频率较高,而且PB转座子受生物体种类的限制性较少。利用PB转座子构成的载体——辅助质粒系统已成功地获得了转基因地中海果蝇、黑腹果蝇和家蚕。
谁都没想到来自复旦大学的科学家们灵机一动,把这个平时没什么人注意的转座子变成人类下一步研究基因功能强大的工具。科学家利用PB作为一种基因载体,快捷插入哺乳动物基因中并保持活性,引发基因突变,籍此了解某类基因的特定功能。如将携带疾病基因的PB转座因子插入小白鼠受精卵的某个基因片段中,便可在长大后的小鼠身上体现此类疾病,通过找寻疾病相关基因,了解疾病机理,从而发展出新的基因治疗手段和药物。
此外,若将携带独特遗传特性基因的PB转座因子插入动物基因中,还能改变原先遗传,产生转基因生物,我们能够在文章中看到通过在小白鼠卵细胞中插入携带荧光蛋白的PB转座因子,而繁殖出的带有红、绿荧光的后代,而这一特性还将代代相传。
这种技术的闪光点在于:较之传统的基因剔除和化学诱变等方法,基于PB转座因子的基因功能研究新方法具有方便、快捷、实用的优点。使用传统方法,2个研究者一年内只能培育出2个基因突变小鼠,因而30多年来,世界科学家仅对10%的哺乳动物基因功能有所研究了解,而如今2个人3个月内就能培养出70个基因突变的小老鼠,于是在短短1年中,许田等人便培育出1%小鼠基因突变品系,从而为大规模培育试验用小鼠提供便利,据许田介绍,今后研究所的实验用小鼠库将扩展至万笼。
相信不久的将来,这项技术可以更广泛的应用在不同的基因功能研究中,大家拭目以待吧(生物通记者 谢菲)。

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