聚焦转染终结篇：RNA\siRNA\Oligo转染注意[心得点评]

    不同的实验技术都是为了满足不同的实验需要，RNA转染提供了另一种有别于DNA转染的研究探索手段——直接将体外翻译的RNA、或者病毒RNA、或RNA oligos，或siRNA、甚至核糖体利用转染技术带入细胞中。由于不需要经过转录即可直接翻译，RNA转染得到的结果比DNA转染更快更直接，当然仅限于瞬时表达。RNA转染的这些特性很适合某些研究：比如处于非分裂期的细胞转染或者很难用质粒转染的细胞，RNA病毒的研究，反义RNA的转染，siRNA转染（RNA干扰）等等。

哪些因素影响RNA转染的效率？
    既然都是核酸，传统的DNA转染方法都可以用来转染RNA，不过最头疼的就是RNA容易降解和防止RNAse污染。
RNA操作要注意的事项我们就不用罗嗦了，转染中要额外注意的就是转染试剂应该是确认无RNase污染的，而且也尽量避免和质粒DNA转染混用——即使试剂本身兼容DNA和RNA转染，你也要想到人家做质粒DNA转染时往往不会这么小心，难免将污染混入，那你岂不是很冤？多数情况下转染试剂都不建议自己分装，因为不同的管材可能会影响转染试剂的稳定性，那就更得不偿失了。所以RNA专用的转染试剂会更好一些。还有重要的一点就是要采用优质无RNAse污染的血清。

    转染时的细胞汇合度常常会比DNA转染高一点，也许是因为RNA转染表达比DNA快？RNA转染的用量必须参考转染试剂说明，因为RNA和转染试剂的比例决定了转染复合物的结构和净电荷，以及是否容易被细胞膜吸附和内吞。RNA少了固然表达不好，太多也会有毒性的问题。有的品牌转染试剂有促核酸凝聚的试剂，帮助核酸折叠为较为致密的结构。如果转染试剂对细胞没有太大影响，转染复合物和细胞共同孵育的时间越长当然越好。不过，如果RNA本身带有荧光标记的化，检测前通常要洗掉多余的RNA以免干扰结果。

    除了操作，RNA本身的结构也对转染有一定的影响。哺乳动物的mRNA分子带有5'端帽子结构和3'端PolyA尾巴，此外还有成为IRES（internal ribosomal entry site）的核糖体结合区，这些结构或者有助于提高mRNA的稳定性，或者有助于核糖体结合到mRNA上进行翻译。对于体外转录得到RNA可以通过实验加入模拟RNA5'端帽子结构类似物而获得这个保护性的“帽子”（Ambion公司有提供的），3'端PolyA尾巴也可以通过实验添加。多数情况下添加这些元件有助于提高RNA进入细胞后的稳定性。但是有时候IRES元件促进翻译的进行，而到有的细胞株中，由于缺乏相应的结合蛋白，IRES反而影响转录。这个在RNA转染实验设计中是要格外注意的。RNA干扰实验中的siRNA结构对基因沉默效果也有影响，比如推荐添加的AA(N19)TT结构（AA(N21)或者CA(N21)也是可以的）。这就不在转染的讨论范围内了。

Oligo转染
    反义寡核苷酸一度曾经是制药领域的希望之光。Oligo的转染还是属于DNA转染，由于分子小，转染的主要问题是转染后的稳定性。2'-O-methyl oligoribonucleotides比一般的Oligo稳定，硫代S-Oligo可以抗拒核酸酶的降解但不可以磷酸化，如何选择就要根据实验目的而定了。

    我们终于结束了转染这一部分。希望对你有所帮助。最后我们再顺带介绍通常在转染时遇到问题该如何面对——毕竟不同的细胞和不同的实验目的，遇到困难往往是难于预料的，所以无论前人是否已经为你提供了现成的方法，如果是除初次尝试某种试剂或者某种细胞系，这几个对照是一定要做的：空白对照，只加一定量核酸的对照，只加一定量转染试剂的对照，2个以上不同的量比实验，对于检查问题是非常有用的。

转染效率低：可能的原因：

• 转染试剂不适合（比如空白对照的细胞存活率就低等等）

• 转染试剂和核酸或者蛋白的量不够，或者比例不对（自行调整咯，别告诉我你不会）

• 基因表达时间（检测时间）有问题（孵育更长时间吧，如果没有毒性问题的化，如果毒性也随转染效率提高，那就要缩小孵育时间拉）

• 副作用（比如目的基因的毒性）（换诱导型启动子吧）

• 核酸或者蛋白质量问题（重做纯化实验）

• 报告基因或者检测系统的问题

细胞死亡率高：

• 过量的转染试剂或者转染复合物（减少用量或者减少孵育时间，转染后洗细胞）

• 细胞问题（重新复苏活化一个细胞株，或者重新传代）

• 目的基因毒性（减少用量）

转染效率重复性差：

• 细胞汇合度不同（保证同样的接种量同样的时间）

• 支原体污染（杀了它吧，重新复苏一管新的）

• 细胞传代次数太高了（重新复苏一管新的细胞）

• 血清质量不稳定（一次囤积同一批号的血清吧）
  
  （马马虎虎的结尾了，大家见谅哈。生物通作者吴畏）