谁可小看“蛋白标准”（上）[选购宝典]

    “大”与“小”的界定真的很难，有时看起来就是无关紧要的细节却偏偏对于结果的影响最大，比如“发现号”的一块隔热材料松脱就有可能造成无法弥补的后果，再比如以前所认为是“垃圾”的DNA却作用强大，还有小小microRNA对整个分子生物学的影响犹如“麦莎”台风过境，可见千万不可忽视任何一个细节。在Western Blot过程中，分子量Marker就是这样一个小细节。这个 Western Blot参照家族的一员（见Western Blot 为什么必须用内参？)的作用主要是用来指示蛋白条带所对应的分子量大小，只有标准量精确无误了，实验结果才有说服力，除此之外，蛋白标准还有表示转移成功或者蛋白在凝胶上的电泳程度等等的作用，所以选择正确的蛋白Marker也是Wb实验成功的必要条件之一。

    环顾各个厂家，蛋白标准分子量产品争奇斗艳，各式各样，但总的来说可以分成未染蛋白分子量标准、预染蛋白分子量标准和修饰标记蛋白分子量标准三个级别，除此之外还有一些特殊的蛋白分子量标准。说起蛋白Marker这东西，想一想好像挺简单，但为什么会有不同的厂家不断推陈出新呢，到底新技术会给我们带给如何的便利呢，还是让生物通“一览众山小”，为您做个scan。

一. 未染色（pre mixed）蛋白分子量标准
    未染色的蛋白分子量标准是最简单，也是最准确的一种。由于没有附带染料分子或者是标记分子，所示大小正好是蛋白原本的大小，是精确判断蛋白大小必须的。现在的Marker多数都选用预混和的Marker，方便不同大小的蛋白比较。预混的Marker通常有几条带加倍浓度作为指示，因为混合的条带越多，越不好记，谁知道哪条是那条！数到眼都花了。所以当看到特别浓的那几条标志带就记得是哪里了。不过要记得，小带通常都不那么容易看清楚的。在选择上来说，当然是选择其中至少有一条条带和自己的目的蛋白大小相近的最好，越近越好。如果你的蛋白不幸在两条跨度较大Marker条带之间，选别的Marker吧。预混的Marker使用上不如预染Marker（pre-stained）好用，因为电泳过程中完全看不到，要和目标蛋白一起等到最后染色才“开蛊”，无法对实验起预示参照作用。完全属于“后知后觉”型的，当然还是比“不知不觉”不做对照的要好。预染Marker要看下集啦。

① 宽分子量蛋白标准

厂家	产品名	Protein Ladder(kD)	包装价格	用量
NEB	Unstained Protein Marker	212, 158, 116, 97, 66, 56, 43, 36, 27, 20, 14, 7, 2/3	0.56ml ￥335 1.12ml ￥756 5.6ml ￥3024	Mini-gel 7ul/well Full length-gel 15ul/well
MBI	Protein Molecular Weight Marker	116, 66.2, 45, 35, 25, 18.4, 14.4	2×1ml ￥420	Mini-gel 5ul/well Full length-gel 10ul/well
GE	Full MW Range	10－250	500ul $201
Bio-Rad	SDS-PAGE Standards, (SYPRO Orange) broad range	4.5-200 6.5-200	200ul
	Precision Plus Protein	250, 150, 100, 75, 50, 37, 25, 20, 15, 0		24 applications 100 applications
Invitrogen	Mark12 Unstained STD	200, 116.3, 97.4, 66.3, 55.4, 36.5, 31.0, 21.4, 6.0, 3.5, 2.5	1ml（200 per vial） ￥1537	Mini-gel 5ul/well Standard-gel 10ul/well
Novagen	Perfect Protein Markers	10-225 15-150	100 lanes $95
Promega	Broad Range Protein MW Markers	225, 150, 100, 75, 50, 35, 25, 15, 10(其中50KD浓度是其它的三倍)	100 lanes
Pierce Bio.	ColorMeRanger Unstained Protein MW Marker Mix	3.5-200	48-96 doses

    如果从实验室总体考虑的，就选范围尽量宽，条带分布比较均匀的，这样你的蛋白无论在哪个区间都容易判断，避免正好落在一段空白区的危险。不过条带越多，每次上样量也就越费。拿到Marker后，如果买的是大包装，就应该考虑分装。多次反复冻融对于蛋白的危险，不用多说吧。另外要记得，宽谱的Marker不一定每条都能看到的，特别是Mini Cell。如果侧重大蛋白，那小的可能就已经跑掉了，不是质量不好哦。

    这一系列的蛋白Marker一般相对贵点（由于制备蛋白比较繁琐）。相比而言NEB的这一宽分子量的蛋白Marker不仅分子量范围大——从2/3到212kD，而且不贵——如果是小胶，每次仅需4元左右，大胶将近9元（0.56ml包装）。而另一个美国公司MBI更是物真价实，每个孔只需1元！（mini-gel）。另外除了价格方面，有些产品作的也十分有特色，比如说Invitrogen公司的Mark12，这种蛋白Marker主要是用在Tris-Glycine 、Tricine或者NuPAGE三种胶上，特色是可以分离分子量十分相近的蛋白，像是在30kD附近，它可以分辨出31kD和37kD这样同在30kD级别分子量的蛋白，这对于有这一需要的实验室人员来说是十分有帮助的。但是记住了Invitrogen的蛋白Mark使用时需要室温溶解，不能煮沸。

② 高分子量蛋白标准

厂家	产品名	Protein Ladder(kD)	包装价格	用量
Bio-Rad	(Silver Stain) SDS-PAGE Standards, high range	45-200	200ul
Invitrogen	BenchMark Protein Ladder	220, 160, 120, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30,25, 20, 15, 10	2×250ul ￥1271.9	Mini-gel 5ul  Full-sized gel 10ul Silver staining 0.2-0.5ul
	HiMark Unstained Protein Stadard	500, 290, 240, 160, 116, 97, 66, 55, 40	250ul   ￥2305	Mini-gel(1.0mm) 5ul  (1.5mm) 7ul
Roche	Premixed Protein MW Marker	39.2-200	200ul	Mini-gel 5ul  Full-sized gel 10ul
GE	High MW Range	14.3－220	250ul   $142
AMRESCO*	High Range Protein MW Marker	212,116,97.4,66.2,40	100ul  ￥187 500ul  ￥892	建议6-8%胶， 点样量：5ul/well

*AMRESCO是一家来自美国，提供生物分子学、生命科学、临床医学、组织学研究用高质量的生化试剂的生产供应商。

    检测大分子量蛋白经常使用到高分子量蛋白标准，这一类蛋白Marker价值也不菲，较便宜的就是AMRESCO的（一次大约9元）和Invitrogen的BenchMark（一次mini胶大约13块钱），而且后者还有15条蛋白带。而在应用上呢，各个厂家侧重点也不同，比较有特色的是Invitrogen公司的HiMark（Invitrogen的蛋白标准命名十分贴切，比如前面的Mark12就是指12条带的Mark，BenchMark就是基准的意思，这里的HiMark是High Mark的缩写），HiMark这种蛋白标准可以说是真真正正的做到了高分子量——它最大的分子ladder可达到500kD！这对于想要分辨200kD以上蛋白的顾客来说确实是个福音，当然这是有凝胶限制的，合适凝胶的是NuPAGE Novex3-8% Tris-Acetate Gel 和NuPAGE Novex 7% Tris-Acetate Gel(有一定的误差)，另外如果你想分离300kD和400kD的蛋白，HiMark也爱莫能助，因为它的条带500kD以下就是290kD，无法正确分辨中间两个数量级的蛋白。

③ 低分子量蛋白标准

厂家	产品名	Protein Ladder(kD)	包装价格	用量
Bio-Rad	Polypeptide SDS-PAGE Standards	1.4-26.6 1.4-97.4	200ul
MBI*	Protein Molecular Weight Marker	116, 66.2, 45, 35, 25, 18.4, 14.4	2×1ml ￥420	Mini-gel 5ul/well Full length-gel 10ul/well
BBI*	Low Range Protein Marker	4.1, 6.5, 9.5, 14.4, 20, 27, 35, 45, 66	30ul   ￥120 100ul  ￥295	用Hoefer电泳系统，8x12cm胶，可供30次上样（100ul包装）。(建议使用分离胶浓度15%)
AMRESCO	Mid/Low Range Protein MW  Marker	97.4，66.2, 40, 26.6, 21.5/19.7, 14.4	1ml  ￥155 5ml  ￥740	建议8-15%胶， 点样量：5ul/well
GE	Low MW Range	16.949, 14.404, 10.7, 8.159, 6.214, 2.512	250ul $142
上海西巴斯生物技术有限公司	低分子量标准蛋白	97, 66, 43, 31, 22, 14.4	冻干粉 ￥85	加入缓冲液配成200ul，每次用10ul。

*MBI: Mathematical Biosciences Institute (The Ohio University)（http://mbi.osu.edu/）
*BBI: 属于赛多利斯的集团子公司，赛多利斯公司是德国股票上市公司中最大的生物技术供应商之一。

    在一般的蛋白电泳当中，更常用的是低蛋白标准分子量，除了有指示蛋白大小的作用以外，有时还可以用作粗略的定量（说不定哪次实验就出现了预料不到的好结果，如果这时发现没加上蛋白Marker，那可真是浪费了）。这样看来，好像低蛋白标准选购时价格高低就代表了主要的筛选标准，其实更应该注重条带的清晰锐利与否，条带均匀与否——纯化不够的Marker会成“团”而不利于判断大小，所以不能单纯以“价格”论英雄。

    实验室用在一般蛋白电泳的低分子量蛋白标准中，经常用到的，看上去也是最便宜就是上海西巴斯生物技术开发有限公司的低分子量标准蛋白了，乍一听这个公司，恐怕很多人都不知道是什么来的，这家公司其实就是中科院上海生物化学研究所旗下的一所独立核算单位，其它自制试剂未见很有名，但它的低分子量标准蛋白和次高分子量标准蛋白在各个实验室中传用的相当广泛。然而实际上，与主流产品不同，蛋白标准Marker，有些进口产品反而要更便宜，比如说上表中MBI的Protein Molecular Weight Marker，仔细算下来，就算是大胶，每次也只要大概2块钱，比上海西巴斯的4元一次便宜了一半，而且MBI的Marker质量在业内口碑一向也不错，虽然如此，可能由于是到货时间长短和服务方便度的一些原因，前者使用的仍然会比较多。除了MBI以外，目前正在打特价的Takara的Protein Molecular Weight Marker也不错，208元可以用大约200次，详情请见特价专栏。

    除了价格以外，在低分子量蛋白标准这里还包括可特别小的蛋白标准，比如30kD以下蛋白或者多肽的分离辨别。其中GE的从2kD到16kD之间有6条带的蛋白标准挺不错，另外提醒一句，特别小的蛋白Marker条带如果要显色好，上样一定要上足够的量哦。 （生物通作者：张迪 吴青）