Western Blot显色篇:八仙过海,各“显”神通(下)[选购宝典]

【字体: 时间:2005年09月26日 来源:生物通

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    Western Blot检测系统中常用交联酶两大家族中的另外一类就是AP——碱性磷酸酶。碱性磷酸酶很早就被用于检测系统——包括固定化抗原(WB)检测和核酸检测。但是做过AP实验的经常会遇到膜上显色背景偏高的问题,所以就WesternBlot本身来说偏爱HRP的要比AP多——分子克隆III解释说由于在我们常用的封闭剂:脱脂奶粉和牛血清白蛋白BSA中富含AP,这样当然显色背景会高。所以分子克隆III推荐的AP适用封闭剂是6%的酪蛋白+1%聚乙烯吡咯烷酮+10mmo lEDTA 65度加热一小时确保AP失活后再用于封闭。一些研究的样本自身也含有较高水平的碱性磷酸酶,虽然实验上很容易实现抑制内源AP影响,但实际上容易被忽略。AP显色底物生成的产物主要是蓝紫色,成像性好容易拍照。早些年前,AP检测的灵敏度比HRP高,但是背景也偏高,整个显色过程更有“技术性”,有许多个人技巧在里面,让人取舍两难。如今由于HRP系的化学发光底物已经不断改进而使得灵敏度不断提高,化学发光显色上HRP和AP不相上下,但是生色反应来说,AP显色的灵敏度还是比一般的HRP显色底物要高。

    AP作为一种经典常用的显色交联酶,自有其优点,比如AP的底物显然更稳定,不像HRP那样需要新鲜配制的H2O2一类的不稳定成分,作为试剂盒可以保存时间更长,也自有一批忠实的”粉丝”(fans),特别是习惯用显色方法检测WB结果的。就像HRP可以用于化学发光和底物显色一样,AP也有这两种常用的检测方法的不同底物。AP显色的灵敏度就已经可以达到低皮克级,前提是封闭要做得好。常用的是BCIP(5-Bromo-4-Chloro-3’-Indolyphosphate p-Toluidine Salt) ,NBT (Nitro-Blue Tetrazolium Chloride)和INT。

 

BCIP

NBT

BCIP/NBT

BCIP/INT

学名

5-Bromo-4-chloro- 3-indolyl phosphate, toluidine salt

nitro-blue tetrazolium chloride

 

 

作用

O2反应形成沉淀

氧化反应

BCIP除了可以和O2反应,也可以用NBT作为电子受体

氧化反应

灵敏度

100pg

100pg

30pg

一般

沉淀颜色

紫色

蓝紫色

蓝紫色

棕红色

用途

AP显色

AP或者葡糖氧化酶

AP,原位杂交和免疫组化

AP和免疫组化

    几乎出显色剂的厂家都会生产到这几种底物,比如Roche的BCIP和INT/BCIP ,Pierce的BCIP/NBT,其中以BCIP/NBT灵敏度最高,显色也比较锐利,成像性比较好,因此也就最常用到。预配的即用型显色底物不存在颗粒性底物,较少产生斑点背景。NEB和Invitrogen也有完整的检测试剂盒。

    还有一些比较特殊的各家的“法宝”,这里要拿出来“显摆显摆”。比如Pierce公司的Fast Red是为Western印迹,点印迹和免疫组化过程中检测AP而专门设计的,这种底物产生的是亮红色沉淀,经过优化,灵敏度高,其中最有趣之处在于其双染色的好处:由于这种亮红色沉淀可以与不溶的HRP底物沉淀无论是NC还是尼龙膜上都能形成醒目的对比,因此可以进行两次显色,检测不同的蛋白。但是要注意的是Fast Red要比HRP底物先加,以防背景颜色加深(Fast Red可能有毒,小心操作哟)。

    AP的化学发光底物可以说是未来创造WB化学酶联底物灵敏度“神话”的希望所在――由于AP在催化脱磷底物方法时转换数高(转换数:每秒钟每个酶分子催化底物转变为产物的量,是酶效率的一个测量单位),可快速产生强信号,因此可以获得非常漂亮灵敏的WB结果,而且不需要像生色底物那样等待半小时才能看结果。

    Invitrogen的WesternBreeze就是检测灵敏度达到Femto飞克级别的AP化学发光法检测试剂盒,而且发光持续时间长达5天!真可谓是AP发光显色中的“恒星”。迅速、安全,灵敏度可比同位素,兼容成像系统,再加上优化后的极低背景,WesternBreeze几乎可以解决你所有的顾虑。而另一个又是来自Pierce公司的产品—Lumi-Phos Wb也是AP化学发光的代表之作,因为Lumi-Phos的灵敏度可以达到低pg级——1.2pg(小鼠IL2为例只需要71 attomoles,10–18 mole), Lumi-Phos都可以帮你检测出来,另外适用这种检测方法的膜还包括尼龙膜——这是许多化学发光底物所不兼容的(尤其是ECL之类高灵敏度的检测方法),可见其信噪比是特别优化过的。Lumi-Phos Wb的发光持续时间是8个小时(2小时内光最强)(据说现在Pierce正在打特价,要赶快行动哦)。

    除了生色底物和化学发光底物,AP的荧光底物也很有特色。Invitrogen的Pre-Q western blot stain kit,是用AP的荧光底物DDAO来显色的,检测灵敏度达到2ng,堪比一般的化学发光检测试剂盒。这个荧光底物的好处在于,经过AP分解后得到的红色荧光产物是稳定的,不会因为底物用完而消退,不需要暗房或者压片,干噪后的膜上更明显,在紫外或者扫描仪上可随时检测。AP的还有一种用于荧光发光检测的AP底物—AttoPhos Substrate(Promega),主要用于Elisa的检测。荧光底物是不同于前两者的酶促显色系统,其最大的优势就是灵敏度(吸收值稳定为前提),这种来源于生物的显色物质不仅可以避免化学物质的毒性,而且显色时可以在低背景的前提下达到0.1 attomole显色级别。这算是体外话了。

    另外还有一种不常用的耦联酶--ß半乳糖苷酶,它的底物中有一个在克隆筛选中鼎鼎大名的化学物质:x-Gal,它与ß半乳糖苷酶反应可以形成一种蓝色沉淀,因此被用于免疫杂交分析中,但是由于不如前两种酶显色灵敏和方便,所以没有这么常用到。

生物通作者:张迪 薇安

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