GPCRs之功能基因组研究

　　

现在药物研发中60~70%的目标蛋白是G蛋白偶联受体（GPCRs）。传统上的药物研发过程是对化合物进行筛选，寻找更有效的新药物分子。而基于化合物结构的药物设计，虽然为研发提供了一个目标；但是由于GPCRs难于进行表达、提纯和结晶，以至于它们的精细结构被了解的很少，因此将结构依赖性的药物设计方法应用到GPCRs上困难重重。进行这方面研究的有专注于特定GPCRs的单个实验室，但现在己开始以大型网络组织的形式建立研究结构基因组的联盟，囊括蛋白表达、提纯和结晶各个领域的专家。其中国内和国际上的不少联盟都已将GPCRs纳入其研究项目。现在，GPCRs的表达系统有好几种，产量已达毫克级，纯度也相当高。但其在结晶上的突破仍需技术上的创新。

药物产业将其财力的主要一部分投入到GPCRs研究中，将其作为新药研发的目标蛋白。现在，三分之二的药物研制项目将目光集中在GPCRs上，前200种药物中有四分之一是基于GPCRs的。这些重要受体组成的蛋白超家族是最大的，其成员数量超过800。GPCRs介导众多细胞信号传导事件，受各种因素诱导，如激素、神经递质、光、气味、味道，等等。它们之所以被称为GPCRs，是因为它们和细胞的G蛋白发生相互作用。当然并非所有信号传递均由GPCRs介导，最近报导的机制中就有例外的，而且亦很重要。GPCRs的序列相似性比较低，但它们都由一个跨膜7次（7TM）的a-螺旋结构，一个胞外的N末端和一个胞内的C末端组成。GPCRs各个亚家族之内倒是有一定相似性。例如，其中最大的一类为A家族，包括光受体（视紫红质）和肾上腺素受体，它们的第三个跨膜结构域在胞内部分的天冬氨酸-精氨酸-酪氨酸序列（缩写为DRY）中的精氨酸是高度保守的。嗅觉受体也属于这个家族。B家族受体都是肽类激素和神经肽的目标蛋白，大约由25个GPCRs组成。C家族成员的N末端异常的大，代谢型谷氨酸受体和y-氨基丁酸（GABA）受体是其中代表。除此之外，还有三个较小的家族：酵母信息素受体类（家族D和家族E），以及盘基网柄菌cAMP受体类（家族F）。因为诱导GPCRs的化合物范围很广，而GPCRs又介导众多信号传导事件，因此它们在生物体中担任许多类角色。GPCRs的突变体会造成各种疾病。举个代表性的例子，GPCRs的活化和抑制在神经传导中有举足轻重的作用，和神经性疾病、神经病变、心脏病、代谢紊乱以及癌症都有关。另外，已经确定人免疫缺陷病毒（HIV）也用G蛋白偶联的趋化因子受体作为其进入细胞时的辅因子。

尽管我们很清楚GPCRs作为药物开发的目标蛋白的重要性，关于它们的结构却了解得相对较少。原因很多，譬如：将它们转运嵌入质膜的效率较低，它们对宿主细胞的毒害作用，本身的不稳定，使得要生产足够多且高质量的GPCRs并非易事。另外，提纯过程中需要添加去污剂，这对GPCRs的产量和稳定性也造成了影响。结晶更是不容乐观，因为本来被提纯的蛋白量就已经很少了，何况还有去污剂存在、受体本身不稳定性和蛋白内含小的亲水环等诸多问题，使得结晶过程中分子不能紧密接触。因此，重组表达的GPCRs的精细结构信息都很不清楚的情况也就不足为怪了。到目前为止，只有直接从奶牛视网膜上大量分离的牛视紫红质成功地被制成晶体，但就算这样，在动物适应黑暗时本需此蛋白发挥功能，此重组蛋白却仍处于非活性状态。

过去的几年里，尽管世界各地的实验室在单独研究GPCRs结构上取得了些许成功，但为了集各领域专家的智慧，且能对大量目标蛋白进行研究，国内和国际上建立了许多网络联盟。在此将介绍这些联盟，以及蛋白表达系统的发展、提纯和结晶的方法。在许多情况下，研究的是全基因组或者至少基因组中的大部分，这被称为“结构基因组学”。显然许多网络联盟会主要选择可溶性蛋白进行研究，这被称作是“啃软骨头”策略，因为这样做的风险较低，也比较容易取得成果。只要看看公共数据库，就会发现关于可溶性蛋白的条目多于25,000，而关于膜蛋白的结构的只有约50条。尽管选择GPCRs蛋白进行研究的成功率很低，不少结构基因组却开始将其纳入研究项目中，例如，MePNet（膜蛋白联盟，www.mepnet.org）就将研究焦点只放在GPCRs上。

 

蛋白表达

重组表达技术是研究GPCRs结构的主要瓶颈之一。每一个可用的表达系统都被测试过（表1）。每个系统进行重组蛋白生产所需的时间显示在图2中。除了大肠杆菌表达系统之外，嗜盐杆菌和乳酸乳球菌等其它原核生物也都被用来做表达的宿主。GPCRs是个跨膜7次的受体，它嵌入到细菌细胞膜时会对细胞产生毒害，通常情况下少量GPCRs就会抑制细菌的表达。另一方面，若GPCRs在细菌中形成包涵体，就算它们高表达，也是以非活性状态存在，需要对它们进行重折叠。在不少酵母株系中研究过各种GPCRs的稳定性表达。例如，用酿酒酵母表达过酵母α因子Ste2p和人多巴胺D1A受体；裂殖酵母被用来表达多巴胺D2的受体，在甲醇酵母中也表达过不少GPCRs。由于用甲醇酵母菌系统生产出的蛋白比活力达25~40pmol/mg，使得该系统成为结构生物学应用中最受瞩目的一个酵母株系。

另外还常用昆虫细胞来表达GPCRs，特别是用杆状病毒载体。用其生产出的人神经激肽-1受体的量达毫克级，蛋白比活力达60pmol/mg。哺乳动物细胞作为表达系统也被试用过，但它产生蛋白的量较少，特别是用遗传稳定性细胞系时更是有限。但用受四环素诱导的稳定表达的HEK293细胞系能生产出毫克量的视紫红质。在哺乳动物细胞中用腺病毒和牛痘病毒等病毒载体能实现重组蛋白的高表达。塞姆利基森林病毒（SFV）是α病毒家族中的一员，被用来进行50多种GPCRs的过量表达，生产出蛋白的比活力高达200pmol/mg，在哺乳动物悬浮液培养基中能提取出高达10mg/L的蛋白量。

最后，尽管有不依赖于细胞的翻译系统被成功应用到许多可溶性蛋白的生产上的情况，产量还相当的高，但到目前为止应用到GPCRs上蛋白表达量还是十分有限。

 

提纯和结晶过程

尽管现在能有效的进行某些重组GPCRs表达，溶解和提纯还需花许多心血。最直接的办法莫过于用表达的GPCRs对去污剂进行筛选，以优化溶解的条件。亲和性标记如多聚组氨酸（His），串联亲和纯化（TAP）和生物素标记都能易化纯化过程。或者，还可以选用抗体或配基亲和层析柱法。为了使GPCRs稳定，用配基、G蛋白、捕获子或其它一些结合蛋白进行共提纯是一个很值得关注的方法。
显然，结晶过程是成功进行结构解析的关健性步骤。超微量分光光度计是一个重大的发明，它让试验结晶条件时所用的样品量减少了，因而可以筛选许多结晶条件。另外，用两性小分子控制微团，用GPCRs的抗体、配基或其他作用蛋白进行共结晶也都是一些方法上的进步。类脂立方液晶载体在其它类型蛋白结晶上获得成功，也许有望被用在GPCRs上。

尽管改进的单微粒成像技术被成功地用于电压门控电子通道研究上，但要用到GPCRs上还需进一步改善。原子力显微镜（AFM）被用于研究视紫红质在天然膜上的结构，也有望被用于解析重组GPCRs的结构。还有，横向弛豫优化谱（TROSY）等核磁共振（NMR）技术已经可以支持膜蛋白的生物结构解析；技术上的进一步飞跃，使它能进行受体-去垢剂复合体的研究，这将为GPCRs的研究提供方便。

 

GPCRs之结构生物学研究

已经有一些GPCRs可以在大肠杆菌膜上过量表达的报导。在这项研究上，Grisshammer等将鼠神经降压素受体（NTR）的N末端删去，代之以麦芽糖结合蛋白（MBP），并在C端连上生物素标记。表达得到毫克级的活性MBP-NTR融合蛋白经抗生素单体层析柱和神经降压素亲和层析柱两步提纯。提纯后的受体用脂囊泡进行再生，再进行固态NMR分析。同样将人腺苷A2a受体（hA2aR）和MBP融合后在内膜上表达，每升培养基可得10~20nmol受体。将Ala316之后的C末端切掉，可得抗蛋白酶消化的功能性蛋白，这样就方便下面的三步配基亲和纯化过程，可以使产物较好的保持其活性。用同样方法，将人白细胞三烯受体BLT1以活性形式从细菌包涵体中重折叠出来。在发酵桶中用甲醇酵母表达载体表达人ETB内皮素受体，可得高达360g/L、比活力为45pmol/mg的蛋白。受体可用n-十二烷基-3-D-麦芽吡喃糖苷溶解，提纯过程所用的方法也很成功。用杆状病毒在昆虫Sf9细胞中表达人神经激肽-1受体，得到的蛋白比活力很高，再用金属螯合物和凝胶过滤色谱法分离。提纯后受体的分子量为50KD，比活力19nmol/mg，和人天然神经激肽-1受体的亲和性也很相近。用受四环素诱导的HEK293细胞系过量表达野生型和突变的视蛋白，可得高达10mg/L的蛋白。而不能合成N-多聚糖的HEK293突变细胞的1.1L悬浮液只能生产6mg受体蛋白，来进行下一步提纯。

 

研究GPCRs功能基因组的网络联盟

国内和国际上许多功能基因组网络联盟都已经将重心放在膜蛋白研究上（表2）。日本RIKEN结构基因组计划（www.rcsb.org）正运行一项鼠基因组研究项目，他们对GPCRs的cDNAs进行筛选。东京生物信息研究中心AIST（www.jbirc.aist.go.jp）的膜蛋白结构基因组项目和日本生物信息学联盟（JBIC，www.jbic.or.jp）都将GPCRs纳入研究对象，采用二维结晶学和电子结晶学研究细菌视紫红素。另外，用杆状病毒载体对如肾上腺素52的受体和它突变体形式等哺乳动物GPCRs进行大量表达后，用于提纯和结构生物学研究。国家科研职能中心（NCCR，www.structralbiology.ethz.ch）是以瑞士人为主的网络联盟，其成员来自苏黎世大学和巴塞尔大学（Biozentrum,www.bioz.uib.ch），瑞士联邦技术中心（ETH,www.ethz.ch）和保罗谢勒研究所（PSI,www.psi.ch）。它们用X射线结晶学、NMR光谱法和电子显微技术发展重组蛋白表达、大分子结构解析和计算机生物学。此联盟以细菌和昆虫细胞来表达研究某些GPCRs。

SweGene（www.swegene.org）是瑞典西南部的一个后基因组研究技术发展项目，其目标是进行膜蛋白的功能研究，并建立了膜蛋白研究平台（MPP），研究一些在大肠杆菌中最初表达的GPCRs。美国线虫结构基因组计划（SGCE, http://scge.cbse.uab.edu），是受国立卫生研究院资助的功能基因组东南联合研究中心（SECSG, www.secsg.org）的一部分，其目标就是研究线虫的全基因组。至今为止，只有可溶性的目标蛋白可用大肠杆菌表达、并提纯和结晶，但基因组还包括GPCRs等膜蛋白，计划将用杆状病毒和慢病毒载体在昆虫和哺乳动物细胞中表达。另一个美国的联盟是功能基因组联合中心（JCSG, www.jcsg.org），它在加州，由Scripps研究所（TSRI, www.scripps.edu）、诺华研究基地（GNF,www.gfn.org）基因组所、加州大学圣地亚哥分校（UCSD）的超级计算机中心（SDSC,www.sdsc.edu）和斯坦福大学的同步加速幅射实验室（SSRL,www-ssrl.slac.stanford.edu）共同建立，将用杆状病毒和腺病毒载体表达约180种GPCRs。

由欧洲资助的网络联盟E-MeP（欧洲膜蛋白联盟，www.e-mep.org）刚开始启动。这个项目研究原核和真核生物的膜蛋白。计划中的200种真核膜蛋白中有100种是GPCRs。他们将尝试采用好几种表达系统。首先用原核系统的大肠杆菌和乳酸乳球菌载体来对不同表达方法进行比较。被测试的真核表达系统有甲醇酵母和酿酒酵母，以及转染杆状病毒的昆虫细胞和转染了杆状病毒的哺乳动物细胞。

2001年9月启动的MePNet（www.mepnet.org）项目为期3年，主要由欧洲资助，研究100种GPCRs。有无高亲和力的配基是目标蛋白选择的首要条件——因为这是能否对GPCRs进行功能解析的必需因素。MePNet的研究过去曾受到几个学术研究组和一家生物技术公司的干扰。

这100种GPCRs的cDNAs被亚克隆到3个表达载体上，在一侧加上选择标记（FLAG蛋白、His标记、生物素标记和Tev蛋白酶切位点），选用大肠杆菌pET15载体和Gateway载体在细菌中表达，甲醇酵母表达载体在酵母中表达，SFV载体在哺乳动物细胞系中表达。免疫检测证明大肠杆菌中大约有50%的目标蛋白表达，而在酵母和哺乳动物细胞中则高达95%。所有细菌中表达的GPCRs都形成了包涵体，需对其进行重折叠以恢复其功能和活性。而用甲醇酵母和SPV表达的蛋白都可以用结合试验测试出来，不少GPCRs的表达量还很高。最高比活力值在甲醇酵母体系中达180pmol/mg，在SFV体系中达287pmol/mg。初步结果还显示60%以上的目标蛋白其表达量达毫克级甚至更高。对细菌表达体系的优化包括对载体和株系的选择。温度对产量也有很重要的影响，对酵母表达体系的研究也证明温度变化的影响。另外在培养基中加入添加剂可以将比活力提高100倍。先前的研究还证明在细胞培养液中加入配基也能提高SFV体系生产出蛋白的比活力。从细菌包涵体中提纯和重折叠蛋白的技术还在研究过程中。大约有20种GPCRs已成功地从酵母和哺乳动物细胞膜上溶解下来，其中10种已进入纯化阶段。目前已经开始尝试第一个GPCRs的结晶。MePNet二期项目开始于2005年1月，同样为期3年，将集中精力对表达情况较好的有限几种GPCRs进行大规模的生产、提纯和结晶。

 

展望

用结构生物学来解析GPCRs结构还困难重重，到目前为止只解析出一个蛋白的精细结构并不足为怪。而且这唯一一个的成功还是由于牛视网膜中视紫红质含量丰富、易于提纯的缘故。其他GPCRs在组织中的表达量很低，只能依靠异源表达技术来生产。如今，随着生产技术的改善，提纯和结晶过程的小型化、自动化，用重组蛋白表达技术已可以得到足够量、高纯度的GPCRs蛋白；但是却一直没能成功结晶出高质量的晶体。对此人们考虑了各种因素：重组GPCRs的质量是否足够高，是否需要有关键的辅因子来改善一下条件，受体的转运和折叠过程是否适当。另外GPCRs的不稳定性和其分子内含有的亲水性小环，无疑也影响着结晶过程。为解决这些问题需要进行更多深入的研究。最好的方法莫过于试用并发展出各色技术、研究大量目标蛋白来试验、摸索，因此只有通过国内和国际的网络联盟才是实现这一目标的有效途径。■

编译/陈文倩 北京大学生命科学学院