10月《自然》子刊关键词：基因表达与芯片

10月《自然》子刊关键词：基因表达与芯片

　　

生物通综合：

微阵列质量问题再成焦点
Veronique Kiermer 

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由微阵列质量控制联盟完成的正式研究报告，为微阵列芯片被人们接受作为一种临床诊断和药物开发的工具，奠定了基础。

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在很多科学圈子里，微阵列芯片的可靠性已经引发了争议。尽管一些报告警示大家说，微阵列芯片导致了结果的不一致性，但一些大的研究组发表的几篇研究报告却认为，只要设计合理和程序之间协调，微阵列芯片能够为不同的实验平台和实验室提供始终如一的可靠结果。微阵列质量控制联盟（MAQC）在九月份的《自然-生物技术》上发表了一套新报告。这套报告尤其直接探讨了在质量调控和临床实践中使用微阵列芯片的可能性。 

对于一个在质量控制实验室工作的人来说，经常会想起存在于研究部门和质量控制部门之间的争论。英语单词“repeatability（可重复性）”或“robustness（耐用性）”在这两种情况下具体涵义差异很大。那些试图发现在一些特定生物学情形下基因表达是否出现分化的研究者，与那些利用数据进行病理诊断的临床医生或者正试图裁定一种潜伏期药理基因组特征是否能支持新药安全性的一个仲裁专家委员会相比而言，他们对其所使用数据可重复性的要求，表现得更为宽容的态度。 

目前，美国食品药品管理局（FDA）虽然并不根据基因组数据来进行监管决策，但他们鼓励那些申报新药的开发者，在其申请材料中也附上这些基因组数据，这样做的目的是监管者能够知晓一些技术性问题，因为监管者最终也将不得不面对这些问题。不幸的是，这些前瞻性的措施除了能提供有关变异性的信息外，在其它方面似乎意义不大。为了启动制定关于微阵列数据使用的框架性工作，建立起一种有关变异性原因的系统分析方法是必要的。鉴于此，FDA启动了MAQC项目，参与者包括美国环境保护局，美国国家标准与技术研究所，微阵列实验平台、学术研究型实验室和其它利益方的主要资助者。 

运用每一平台的多重检测位点，该研究组收集到了一些利用技术进行重复的结果，它们源于六种商业性平台上的两种不同的参考性RNA样品和一种来自美国国立癌症研究所的点状寡核苷酸阵列平台。这六种商业性平台包括Applied Biosystems、Affymetrix、Agilent Technologies、GE Healthcare、Illumina和Eppendorf。 

这些试验结果是鼓舞人心的，因为它们显示出了在不同实验室之间平台内部的高度民主一致性、在微阵列试验平台之间高度可对比性以及和其它基因表达方法的高度相关性，比如定量的反转录PCR方法。但是，通过设计，这一操作方法并不能在各套数据之间提供一种绝对一致性的测量方法。例如，它利用技术对样品进行重复后再测定，而这些样品本来就是不一样的。很可能，那些在基因表达方面有着更细微差异的“现实”样品，在一致性方面并不能反应出同样的水平。不过，这些数据系列很好地表现出了该技术平台的特征。 

这项研究特殊性的另一种反应就是对于数据分析运算法则方面的考虑。这些研究者喜欢使用一种直接方法，他们根据其表达倍数的变化来对基因进行分级，并有着非显著性的P值减少，这种统计学分析最不可能适用于那些专注于发现基因标签的研究。但是，当这一方法用于确保一个已有基因标签的可重复性时，比如运用于诊断装置，它的使用效果很好。正如Affymetrix公司的Janet Warrington所言，“如果你要做的是发现性的工作，你就想观察到每一件东西。但如果你正在开发一种诊断性的标签，在你运行试验时你最终想做的事情就是找到新东西。” 

但是，对MAQC操作在监管方面进行设计调整，并不意味着它对于研究申请来说毫无意义。相反，它已经提供了一种独一无二的机会，例如，为总体质量评估评价出外部RNA控制来。最重要的是，人们目前可得到一大套数据，还包括参考样品，之所以这样选择是因为它们的制造商已经保证几年内都可以提供这些同样的特定批次。运用这些工具，人们可以在一个较以前更好的尺度内进行性能方面的对比研究。 

这里建议，对于有关问题也可以参阅发表在九月份的《自然-生物技术》上的一些其它相关的研究报告。

科学家为基因表达实施快速拍照
Irene Kaganman 

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有越来越多的证据表明，基因表达的动力学特征较人们先前想象得更为复杂。对哺乳动物细胞中的mRNA表达实施灵敏的快照技术，揭示出了在外部刺激缺乏的情形下基因表达产生的显著的随机时间变化特征。

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活体检测具有很多优势，尤其是当你想了解实时的动态变化时。然而，有时侯要想获得详细的时间变化数据，通过进行极为精确的快照测量要比进行较少精确的活体记录更为容易些。 

来自美国纽约大学和公共卫生研究所的Arjun Raj、Sanjay Tyagi和他们的同事采用这种策略发现了哺乳动物细胞在大型的内在随机型脉冲状转录活动中发生了基因转录现象。在以前的研究中，人们使用绿荧光蛋白法（GFP）和荧光显微镜法，检验了活的细菌或酵母中基因表达的时间动力学特征。这些研究间接证实，转录现象呈脉冲状发生。取而代之的是，MS2的RNA束缚蛋白质的一系列束缚位点能够被添加到某一目标基因上。一种GFP-MS2融合蛋白可以稳定地在细胞中进行表达，目标mRNA水平上的变化可以通过查看GFP定位的改变来进行观测。这项技术为细菌中发生的适度脉冲状转录现象提供了证据。 

但是，这些方法也有缺点。“荧光蛋白存在着问题，它们对实际发生的转录过程并不提供一种很好的指示特征，”Raj评论说。因为GFP非常稳定，它实际上代表着转录水平的一种动态平均值。虽然GFP-MS2束缚方法能提供有关mRNA的实时信息，但它受到高背景值的干扰，也会影响试验的灵敏度。 

Raj及其同事认为，他们能通过放弃活细胞成像法，转而对整体混合的细胞中的mRNA分子进行精确而灵敏的测定，就可以克服上述缺点。他们在报告基因的3'端放置32条重复序列，然后把它们整合到哺乳动物细胞的基因组之中去。接着，他们运用包含有五种荧光团的探针，进行了RNA荧光原位杂交试验（FISH）。结果发现，他们能通过测量荧光显微快照中单个的点，检测到单个的mRNA。Raj设计出了软件，来对这些FISH点进行自动识别并对数据进行分析。 

也许有人会认为，这对于判定基因表达的时间变化并不是非常有用，但是，事实上它的功能相当强大。Raj说：“如果你假定，细胞种群中所有单个细胞的快照点代表着该细胞随时间而出现的实际情形的话，那么你就能从整个种群中推测出单个细胞的行为。” 

他们发现，对于不同细胞来说，FISH快照点变化很大，这表明基因激活呈现了特别不协调的脉冲特征。“活体成像对于这类研究来说，相比来说用途更少，”Raj评论说。“它的主要优点在于，相对于其它方法来说，它能发出更强的信号。”研究者应用统计分析方法，获得了转录脉冲的频率和它们的平均值。 

他们利用这种方法的高灵敏性，来检测一种内源基因的表达，该基因包含有天然重复的序列。由于把不同颜色的荧光团添加到FISH探针上很容易，他们甚至能够把mRNA从多重基因中立即检测出来。 

虽然，在那个能对活细胞中单个mRNA进行可靠检测的圣杯制造出来之前，在这一领域进行方法学上的改进仍有很大的想象空间，但这一研究工作表明，把一些过时的技术和精细分析方法紧密地结合起来进行应用，仍然能够产生很好的效果。

控制转基因表达变得更加容易
Michael Eisentein 

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通过在翻译水平进行调控，而不是在转录水平进行调控，研究者找到了一种潜在的更为简单的方法，来对转基因的表达进行有效地控制。 

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在当代，对基因表达进行外部控制的策略通常会涉及改良性的启动子和工程化的转录因子，而且，目前很多选择，包括像四环素诱导的各种系统，已经具有可行性。这些系统具有特色鲜明和诱导性强的优点，但也具有局限性，比如在将多重工程序列引导入目标细胞中的需求方面，以及缺少调控未修饰性内生启动子表达的能力。 

早在2004年，哈佛大学医学院的Richard Mulligan及其同事公布了一种方法替代传统的转录控制模式，目标抄本在这里被连接到一种核酶功能域中，该核酶功能域的裂解活动性是由一种小分子配位体调控的。更近发生的事情是，Mulligan的研究小组已经开发出一种甚至更为简单的解决方法，来对外源基因进行调控，这一策略要求仅仅引入一种单一的密码子序列，来对蛋白质生产实行强势的调控。 

已有的几项研究表明，像G418这类的配糖类抗生素是能够抑制哺乳动物细胞中的无义突变的。根据这些发现，Mulligan的研究小组检验了G418对于人体阿朴脂蛋白CII-荧光素融合基因表达的相关调控能力。他们发现，在人体细胞中仅仅低水平的荧光素酶活动，才能以滤过性毒菌的方式将这一转基因进行转录；但是，G418的介入导致了荧光素酶活动中一种浓度依赖型的增加，野生型活动最高可达72.8%。他们在诱导1小时之后就迅速对翻译的恢复进行了检测，最迟也不会晚于48小时。这种方法应用于几种不同的人体细胞系都表现得很好，其它配糖类物质也被证明对于无义抑制是合适的，虽然G418是最有效的。G418也被证明是能够强烈而且特定性地诱导体内的荧光素酶活动，这既发生在那些气管中感染有滤过性毒菌生成的小鼠中，也发生在那些经过致死辐射的小鼠中，它们的骨髓是利用滤过性毒菌诱导的造血干细胞重新生成的。 

研究者并没有观察到这些研究中所使用的剂量产生了什么毒性效果，但是，仍有相当多的证据表明G418具有毒性，而且，Mulligan的研究小组也对两种具有无义抑制能力的配糖类化合物进行了有效性方面的检验。两者都不如G418有效，但是，两者都被证明是能够在一定程度上恢复诱导细胞系中荧光素酶的活动，而且不会产生明显的毒性效果。这些化合物相比较而言仍然很新，从毒理学角度讲特征也不突出，但是，它们展示出了识别其它小分子催化剂有效性的潜力——虽然研究者提示说，这里发现的G418毒性缺少仍然鼓励人们在设计试验时使用这种方法。 

这一系统看起来为我们提供了一种替代基因有效控制的神奇的简单方法，它最小限度地仅仅需要一种单个终止密码子的插入。对于这一系统来说，很多问题仍然需要澄清——例如，不同种类的终止密码子的效果看来是可变的和环境依赖型的，终止密码子插入到目标蛋白质上的潜在效果如何是不清楚的。然而，Mulligan和他的同事认为，随着进一步在精细方面进行努力，这一方法可望对于科学研究和基因治疗应用来说都是一种强大的工具。“事实上，在任何表达载体存在的情况下，建立起调控机制应该是可能的，”他们推断说，“而且，要在它们正常的内源性的控制成分存在的情况下，为那些编码蛋白质序列的表达调控做准备。” 

其它内容：

新方法探明碳水化合物的生物学功效
Allison Doerr 

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通过将一种改进的寡糖合成方法，与蛋白质束缚和细胞生长试验联合起来使用，美国加州理工学院的研究者能够查明特定粘多糖硫酸化类型的生物学功效。 

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对于全球各地的普通节食者来说，碳水化合物是大敌；对于很多化学生物学家来说，碳水化合物却是相当受欢迎的。 

存在于寡糖和多聚糖序列中的碳水化合物，是极为重要的蛋白质修饰物，它涉及到无数的生物学功能，范围从发育到免疫反应，再到细胞间信息传递。研究蛋白质的糖基化过程是一项很有挑战性的工作，因为碳水化合物具有复杂的结构。而且，它们很难通过遗传干涉来进行探测，原因是糖基化过程是一种非模板化的后翻译过程。幸运的是，由于研究者已经开始意识到糖基化过程在生物学和医学方面的重要意义，各种研究工具目前正被快速研制出来。 

美国加州理工学院的Linda Hsieh-Wilson教授及其同事，目前对一类名为粘多糖（GAGs）的碳水化合物很感兴趣，兴趣点包括它们在神经元发育和再生过程中的角色。GAGs经常会产生不同类型的硫酸化过程，它们牵涉到对各种生物学过程进行重要功能信息的编码。“GAGs具有的复杂化学结构，为蛋白质束缚和调控提供了指令，”Hsieh-Wilson解释说。 

但是，直到现在，研究者还无法对这些硫酸化过程序列在分子水平上进行理解，主要原因是GAGs的化学合成极端困难。Hsieh-Wilson及其同事采取的第一个步骤是，设计出一种改进的合成路线图，利用各种不同的硫酸化过程来合成四糖硫酸软骨素粘多糖。“在我的实验室中有两到三个人四年来始终专注于这一研究项目，目标是不仅要合成出一个分子，而且要合成出很多不同的分子，我们要用它们来控制硫酸化的类型，”Hsieh-Wilson说。 

在掌握了软骨素硫酸盐序列的前提下, 研究者把这些分子固定在一个微阵列操作台上, 以便观察它们与生长因子MK之间的相互作用, MK涉及到神经组织的发育和修复。MK被牢固束缚于一种名为CS-E的硫酸盐序列上。而且，他们发现，起源于大脑的神经营养因子，也对CS-E有一种强烈的偏好。神经营养因子涉及到神经系统的发育调控。 

接着，他们调查了各种硫酸化类型对于初级海马神经元细胞生长的影响。不容置疑的是，他们发现CS-E对于神经轴突派生是必需的，神经轴突可以生长在涂有这一分子的表层上；当表层涂上其它分子序列时，细胞生长就不会发生。“甚至一种和CS-E极为相关的类似物， 它也具有相同的结构和全部的电荷，但就是没有什么效果，这表明蛋白质和粘多糖之间的相互作用是具有高度选择性的，”Hsieh-Wilson说。CS-E也刺激其它几种神经元细胞的派生；通过阻止MK受体和源于大脑的神经营养因子的受体，可以对CS-E的活动进行抑制，这表明，该序列可以补充生长因子，激活下游的信号途径。 

根据这些结果，研究者假定存在着一种精确的硫酸化编码，它决定着软骨素硫酸盐的主链。 “仅仅使用生物学方法来探究这些分子的相互作用，是具有挑战性的，”Hsieh-Wilson评论说。“有机合成化学的方法能提供独一无二的见解，而且，当你把它和另外一系列生物学技术联合使用时，你就能够开始触及到一些真正有趣的问题。” 
（以上内容来自Nature China）