许左尚：如何设计特异性siRNA

许左尚：如何设计特异性siRNA

　　

生物通综合：来自美国马萨诸塞大学医学院的研究人员在siRNA特异性研究方面获得了突破，这一研究结果公布在《Nature Methods》杂志上。

小干扰RNAs(siRNAs)是指能够减少目标mRNAs表达的小型RNAs。近来，生物学家已经把siRNAs作为一种重要的工具投入到应用中。siRNAs也具有临床治疗的潜在意义，它可以作为治疗剂用于减少致病突变基因的表达。但是，为了释放出siRNAs全部的潜在功效，弄清楚目标特异性的管理规则就变得非常之重要。一个主要的挑战就是要开发出siRNAs，使它能够区分出同一基因的两个相似变异体，这样其中的一个基因变异体被剔除，而其它的变异体则安然无恙。

由美国马萨诸塞大学医学院的Phillip Zamore、Zuoshang Xu和Neil Aronin共同领导的研究小组解决了这一问题。Zamore 回忆说：“开始时，我不仅仅确信，很容易找到设计能区分基因变异体差异的siRNAs的规则，而且我还认为对这些规则已经了解得相当多了。很显然，我这样想是错误的。事实证明，这一工作比我想像得更难、更有趣。”

在他们大部分的研究工作当中，Zamore将目标集中到了SOD1基因方面。SOD1中单个碱基对的突变能导致家族性神经疾病肌萎缩侧索硬化症(ALS)的出现。患有家族性ALS的个人经常同时携带有该基因的一个正常体和一个突变体。因此，研究者在保持好该基因正常的功能与基因表达的同时，还渴望能找到一种减少突变体SOD1表达的方法。作为完成这一目标的第一步，Zamore及其同事找到了一系列的siRNAs来定位SOD1。每种siRNAs都在不同的位置上把一个碱基对错配到野生型的SOD1上，但是，所有这些siRNAs都完全与突变型SOD1相匹配。这些研究者希望，其中的一些siRNAs能剔除掉SOD1.的突变体，但同时不对正常基因产生影响。

Zamore及其同事通过系统检验这些siRNAs，发现在siRNA中那个不匹配的碱基对的位置对于选择性的建立是极端重要的；如果这种不匹配位于一些特定的位置，该种siRNA则无法有效地区别SOD1的正常体和突变体，这样将会减少这两种SOD1的表达。一般来说，当不匹配位置不在该siRNA的5''''种子区，而且不匹配的最有效位置在该种siRNA的核苷位置16时，他们能更好地进行区分。为什么这些不匹配现象在进行区分时比其它的类型更有效呢？虽然人们目前并不完全清楚这一原因，但Zamore坚信，他们也许会影响某一机制，通过该机制siRNAs引起了目标退化：“我怀疑是这些不匹配通过Argonaute蛋白阻碍了mRNA裂解，但并没有同时阻碍目标RNA的束缚。从某种感觉上讲，它们使得RNA诱导的沉默复合体(RISC)产生了无效束缚。

有趣的是，有迹象表明，核苷位置16对于植物性微型RNAs是重要的，它希望哺乳动物的siRNAs通过在单个的磷酸二酯键上引导Argonaute蛋白进行目标mRNA的裂解来起作用。因此，一旦这种siRNA引导被限制到RISC中的Argonaute蛋白上，那就必定在核苷位置16上存在着一些特殊的东西。”在另一套试验中，这些研究者发现，两种嘌呤之间的这些不匹配对于区别两种相似的基因突变体，比存在于单个嘌呤和单一嘧啶之间的一个不匹配表现得更为有效。

除了对于siRNA设计建立起重要的指导之外，这项研究也促成了高度特异性的siRNAs的建立，它对ALS疗法非常有帮助。但是，Zamore提醒说，“对于ALS来说，运输问题依然是一个巨大的障碍，因此我无法预测还需要多长的时间，我们才能将siRNAs引入治疗过程之中，来对付这一恐怖的疾病。”

RNAi实验用户手册中文版(I)RNAi实验用户手册中文版(I)

RNA干扰（RNA interference, RNAi）是由双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)引发的转录后基因沉默机制，这种真核生物中普遍存在的抵抗病毒入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制目前已成功用于基因功能和信号转导系统上下游分子相互关系的研究。随着研究的不断深入，RNAi的机制正在被逐步阐明，而同时作为功能基因组研究领域中的有力工具，RNAi也越来越为人们所重视。

目前这一技术已经进入了生物科学研究的许多领域，成为了一种主要的生物学研究工具，发展得相当迅速，并受到了此次诺贝尔奖评审委员会的青睐，获得2006年诺贝尔奖医学/生理奖。然而这一才历经十个年头的技术依然对于许多研究人员来说还是很陌生的，生物通编译收集了一些研究文章和综述，聚焦RNAi技术最常见的一些问题，希望能给国内已经从事或希望接触RNAi实验的研究人员以帮助。

Chapter I  如何挑选特异有效的siRNA？

小分子干扰RNA（siRNAs）已经广泛的用于序列特异性基因敲除，在脊椎动物细胞基因功能检测，以及作为治疗性药剂方面发挥着越来越重要的作用。

但是要挑选特异并且有效的siRNAs并不是一件容易的事情，这主要是由于并不是所有的与靶标mRNA同源的siRNAs都能有效，而且target-complementary siRNAs也会非特异性地靶向其它的mRNAs（包含与siRNAs部分互补的片段序列），虽然目前已经有了大量计算机工具生物信息学的辅助，然而在操作上挑选siRNAs仍然有一些要注意的地方。

一、siRNA筛选总论

1. 靶标mRNA分析

靶向目标基因的siRNAs筛选一般从靶标mRNA注释序列开始，主要包括5’和3’非翻译区（UTRs），剪切，多态性和等位基因突变。由于编码基因的mRNA序列信息是最可靠，因此常以此来作为靶标，而UTRs通常了解的比较少，但也可以利用相似的基因敲除率（gene-knockdown efficiency）来靶定。当然，虽然UTRs常被推荐用于避免包含有mRNA结合蛋白的绑定位点，比如the exon-exon连接复合物等，但是在这个方面并没有详细的实验数据。

因此出于操作的考虑，siRNA的筛选有许多额外的限制，比如分辨出靶标orthologs（指起源于不同物种的最近的共同祖先的一些基因）的是来自一个以上的物种还是一个基因的所有可能的剪切突变。

2. 已公布和有效的siRNAs数据搜索

在以下可以找到一些实验验证的siRNAs序列，

Ren, Y. et al. siRecords: an extensive database of mammalian siRNAs with efficacy ratings. Bioinformatics 22, 1027–1028 (2006).

Chalk, A.M., Warfinge, R.E., Georgii-Hemming, P. & Sonnhammer, E.L. siRNAdb: a database of siRNA sequences. Nucleic Acids Res. 33, D131–D134
(2005).

Truss, M. et al. HuSiDa–the human siRNA database: an open-access database for published functional siRNA sequences and technical details of efficient transfer into recipient cells. Nucleic Acids Res. 33, D108–D111 (2005).

除此之外，从一些商业来源也可以获得有效的siRNAs（比如Qiagen的HP validated siRNAs，Ambion的the Silencer validated siRNAs），而且像Qiagen这样的公司也提供预制的siRNAs和顾客定制服务。当然也要提醒一下，虽然这些预制试剂能提供很好的RNAi实验结果，但是还是要检测这些siRNAs是否有效和对于自己是否合适。

　

3. 挑选运算方法和siRNA序列筛选工具

近年来，在固有序列和稳定的功能性siRNAs的研究基础上已经发展出了几种siRNA序列筛选运算规则，其中一小部分考虑到了二级结构和靶标mRNA的可行性（是否容易获得），而且这些运算规则的方法涉及到了从完全经验性的观察到熟练的机械计算的各种范围。

在从靶标mRNA序列中筛选出siRNA序列后，每一个候选的siRNAs都需要在全基因组水平上验证是否会与无意中被靶定的其它mRNA转录本相似。大部分的运算规则都包含各种这样的程序，以下是一些网站列表。

（点击看大图）

4. siRNAs验证

因为要确定每一个siRNA基因敲除的精确水平是一个严格要求的过程，而且对于新的靶标基因又需要各种实验，所以以融合报告系统为基础的实验可以加速在不同的合成的siRNAs中识别有效的siRNAs。

在这些系统中，可以利用包含靶标序列和融合报告基因，以及用于标准化的对照基因的质粒，联同靶标特异性siRNAs共转染进细胞中。这里要提一下来自Promega公司的以双荧光素酶（dual-luciferase）为基础的siCHECK系统，这种系统应用广泛，可以在24小时内得到siRNAs活性的ranking，方便快捷（这些以报告系统为基础的 activity通常与内源性靶标剔除的有效性有关）。利用这些预证siRNAs可以用于验证内源性靶标mRNA的沉默，详细的内容可以参考这篇综述：Cullen, B.R. Enhancing and confirming the specificity of RNAi experiments（Nat. Methods 3, 677–681 (2006)）。
（未完待续）