RNAi技术策略(哺乳动物细胞篇)[心得点评]

RNAi技术策略(哺乳动物细胞篇)

目前RNAi技术已经进入了生物科学研究的许多领域，成为了一种主要的生物学研究工具，发展得相当迅速，并受到了此次诺贝尔奖评审委员会的青睐，获得2006年诺贝尔奖医学/生理奖。然而这一才历经十个年头的技术依然对于许多研究人员来说还是很陌生的，以下是有关RNAi技术在哺乳动物细胞中应用的具体设计策略，主要来自于《遗传》杂志2005年“RNA干涉（RNAi）技术应用于哺乳动物细胞的研究策略”（见http://www.ebiotrade.com/custom/2006/060904/index.asp），希望能给从事或者准备从事RNAi相关实验的研究人员以帮助。

一、靶siRNA序列选择

靶siRNAA序列选择是RNAi实验成败的关键。哺乳动物细胞RNAi实验中，使用最广泛且最有效的是21bp siRNA。siRNA由正义链和反义链组成，两条链3’端均有2个碱基突出，一般为UU或dTdT，其中正义链的前19nt与靶基因序列相同。

1. siRNA设计的原则

SiRNA双链设计时，一般在靶mRNA起始密码下游100—200bp至翻译终止密码上游d0—100bp的范围内搜寻AA序列，并记录每个AA3’端相邻19个核苷酸作为候选si.RNA靶位点。其中AA（N19）TT是最理想的序列，若靶mRNA中无此序列，亦可选用NA（N21）或NAR（N17）YNN（R表示嘌呤，Y表示嘧啶），但在合成时，siRNA的正义链3’端需用dT—dT代替。TuscRl等建议设计的siRNA不要针对mRNA的5’和3’端非编码区，因为这些区域有丰富的调控蛋白结合位点，而UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP（siRNA protein complex，核酸内切酶复合物）结合mRNA，从而影响siRNA干扰的效果。最后还应将候选siRNA序列在GenBank进行BLAST检索，与非同源基因具有3个或3个以上碱基相异的序列方可选用。

2. 高效siRNA的序列结构特征

除了靶序列位点的选择，siIRNA序列本身结构特征亦会影响到RNAi效率。RNAi实质上可视为一个RNA与蛋白质互作过程，包括siRNA与RISC结合、RISC的激活以及RISC与靶mRNA的结合和切割，这种互作效应的存在，往往造成siRNA链的选择具有偏爱性。Reynolds等通过对2个基因的180条siRNA序列分析，归纳出以下8个与
siRNA高效性相关的特征:G/C含量低(30%-52%)，正义链3’端具较低稳定性（有利于siRNA与RISC的结合和解链），无反向重复序列（有利于减小siRNA的有效作用浓度，提高siRNA干扰效率），正义链碱基的偏爱性A19（正义链中第19位碱基为A，如下表示类同）；A3；U10；无G/C(正义链中第19位碱基不为G或C)；无G13。依此规则，Reynolds等设计的30条siRNA中有29条是有效的。Kumiko等亦认为siRNA反义链5’端为A/U（即有义链U/A）19和最后7个碱基中有5个A/U，会有助于RNAi的高效发挥，且正义链G/C1和序列中无连续9nt以上的GC重复片段与基因沉默效率呈显著相关。有趣的是，该实验还表明这些规则同样适用于DNA介导的RNAi（DNA-based RNAi.）实验。此外，Amarzguioui等发现正义链5’与3’端的前3个碱基中A/U含量不对称(3’端含量应高一些)和A6对siRNA 的活性亦影响很大。根据上述结果，可以初步绘制出一个高效siRNA序列结构的精细与简略示意图。

现已知道siRNA的反义链决定着靶位点识别，那么在不影响siRNA作用功效的前提下，是否可以对其正义链碱基作适当更改或修饰呢？Amarzguioui等研究siRNA不同部位对碱基突变和化学修饰的耐受性，认为siRNA的5’端相对于3’端具有对突变的较高耐受性。有学者认为正义链3’突出端的任何碱基修饰对siRNA作用效果均无明显影响。还有学者认为与反义链互补的正义链3’端发生1—4个碱基的错配反而有助于增强RNAI的活性。

二、siRNA制备方法

1. 化学合成
早期RNAi实验中，ds.RNA或siRNA均由化学法所合成。化学合成的siRNA纯度高，合成量不受限制，且还可对siRNA进行标记，方便对其跟踪，但该方法价格昂贵，不适用于siRNA序列的筛选和长期基因沉寂实验。目前Proligo、Dharmacon Research和Ambion等公司均提供siRNA合成服务。

2. 体外转录法合成siRNA
相对于化学合成而言，体外转录法合成siRNA较为经济。根据siRNA序列合成相应DNA Oligo模板，再利用T7RNA聚合酶进行体外转录，分别获得siRNA的正义链和反义链，然后将其退火、纯化即可得到能直接导入细胞的siRNA。体外转录法最大缺点是siRNA合成量受限制，不过其价格较低，毒性小，稳定性好，效率高。目前国外一些公司均有采用此方法的试剂盒出售，如Ambion公司生产的Silence siRNA Construction Kit。

3. “鸡尾酒”法
“鸡尾酒”（cocotail）法原理是采用Rnase III消化长片段dsRNA来获取siRNA。基本步骤如下：
针对靶基因mRNA(通常选取200-1000bp)在体外转录成长dsRNA；
用大肠杆菌Rnase III酶或Dicer酶对dsRNA进行酶解，得到一组siRNAG混合物；
消除未被消化的dsRNA，剩下siRNA混合物可用来直接转染细胞。
利用此方法可以省略较为繁琐siRNA设计与筛选工作，且能够保证靶基因被有效抑制。该方法适合于快速而经济地研究某个基因功能缺失表型，但因所使用siRNA为混合物，无法确定有效的siRNA靶序列，并有可能产生非特异性基因抑制。

4. SIRNA表达载体
上述3种方法均为体外合成siRNA，不宜进行长期基因沉寂研究。借助表达质粒或病毒载体在细胞内产生siRNA，使研究者无需直接操作RNA就可达到长期抑制靶基因表达的目的，且载体上的抗性标记有助于快速筛选出阳性克隆，这将具有更为广阔的应用前景。

shRNA表达质粒多采用RNA聚合酶III启动子，如人源H1或鼠源U6启动子，pol III在哺乳动物细胞内引导非编码小RNA的转录，转录产物无poly(A)尾，且在转录过程中遇到连续4-5个U时转录终止。此载体最后转录出的产物是经折叠形成的发夹状小RNA(shRNA)； shRNA 在细胞内被Dicer酶切割成3’端带有两个U突出的siRNA，进而启动RNAi，介导基因沉默。载体中的间隔序列为9个核苷酸时最为有效。

用病毒载体介导RNAi近年来受到人们重点关注。利用病毒载体可以解决质粒转染效率低、效果不稳定且某些类型细胞不能转染等问题，从而扩大RNAI应用范围。常见病毒载体有腺病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等。腺病毒是无包膜的线性双链DNA病毒，可以高效地转导不同类型的哺乳动物组织细胞，但不整合到宿主细胞基因组中。逆转录病毒属于正链RNA病毒，宿主范围广，感染效率高，并能稳定整合到宿主细胞基因组中，但其只能感染分裂细胞。慢病毒对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，且较于上两种病毒体系而言，还适合通过感染胚胎干细胞或胚胎来制备RNAi转基因动物。

5．siRNA表达框架
siRNA表达框架（siRNA expression cassettes, SECs）是一种由PCR反应得到能在细胞内表达siRNA的DNA模板，其结构为[RNA pol III启动子-表达siRNA的发夹状结构序列RNA pol III]，所获得的PCR产物可直接导入细胞。该方法最为简易省时，适用于筛选siRNA及在不同宿主细胞中转录启动子与siRNA靶序列的最佳组合。

三、siRNA的转染

将siRNA、siRNA表达载体或SECs导入哺乳动物细胞中是诱导RNAI发生的关键。有许多转染试剂可供选用，最常用的是脂质体转染试剂。某些情况下电穿孔法亦可用，但易导致较高的细胞毒性反应。对于同一细胞系，使用不同的转染试剂或方法，其效率往往会有所不同；而对于不同的细胞系，使用同一种转染试剂或方法，效果亦会不同。因此在实验过程中，有必要尝试多种试剂或方法来确定最优条件。转染效率可通过测定细胞的密度，转染的时间和siRNA与转染试剂的比例来评价。

四、实验对照设置

实验对照是衡量RNAi.实验数据可信度的一个重要因素。设立阳性对照目的是通过检测不同浓度的siRNA转染效率及其最终干扰效果，来确定合适的转染条件和最低有效的SIRNA浓度。有实验表明RISC复合物具有饱和性，且过多siRNA会导致细胞毒性和死亡。对于大多数细胞，持家基因（如GAPDH，c-cmyc, β—acion等）是较好的阳性对照，针对这些基因的高效SIRNA序列已有报道。阴性对照是用来检测RNAi的特异性。通常作为阴性对照的siRNA与选中的siRNA序列有相同碱基组成，但与靶mRNA无明显同源性。阴性对照的siRNA序列设计有2种方法，一是将特异性siRNA的序列打乱，即“零乱”siRNA（scrambled siRNA），再对其进行BLAST比对，防止与目的靶细胞中的其他基因有同源性；另一种是在特异性siRNA中引入几个错配碱基。若引入的是一个碱基错配，应需考虑它与突变mRNA(即SNP位点)结合能力，最好在设计siRNA时就避免SNP区。

五、RNAi效果检测

RNAi效果可从mRNA和蛋白质两个水平来进行量化。在mRNA水平上，Northern Blot和实时定量PCR是两种常用方法。值得注意的是在进行实时定量PCR时，cDNA合成要用oligo(dT)，而不是随机引物，且预扩增片段最好位于靶mRNA序列中siRNA位点的上游。蛋白质水平可以通过Western Blot、荧光免疫检验法、流式细胞分析术和表型分析来检测。RNAi一般在转染后24小时内发生，其引发基因沉默的程度和持续时间依赖于靶蛋白质的降解率(turnover rate of the protein)、siRNA在细胞内的寿命以及其逐渐被稀释的程度。