实时定量PCR的五个问题 -实时定量PCR|内参|TRI试剂|降解-生物通

生物通报道:实时定量PCR(Real-time quantitative PCR,QPCR)技术使mRNA定量、基因分型（genotyping）和微列阵数据检验变得简单智能。但是“简单”也只不过是赞美，真正进行QPCR时，其中的缺
陷接踵而来。引物和探针设计、样本制备和选择控制（control selection）标准化都是一些潜在的障碍。修斯顿Texas大学保健科学中心Quantitative Genomics核心实验室主任Greg Shipl说，“需要进行许多虚拟工作”，从确定靶基因是否有突变到保证靶基因的特异性。

1 标准是否符合实际？

I-Hsiung Brandon Chen以前在加州Scripps研究所，利用罗氏LightCycler 2.0和SYBR Green chemistry，建立RT-QPCR分析技术，验证DNA芯片收集的基因表达分析资料。Chen 说：“在实现标准化的过程中，我认为最常见的问题是选择对所有基因进行规范化的最佳内参基因。我需要进行六次检测，才能筛选出1个或2个比较稳定的（内参基因），其它4个会随着处理发生变化。” 目前还没有设计内参的标准。怎样选择符合实际的内参？

不幸的是反复实验以内参为标准，宾州大学Huck研究所生命科学核酸设备研究计划主任Deborah Grove说。对每个经过处理的样本的一部分进行检测，观察预期表达稳定的转录本（如看家基因GAPDH或者beta-actin），如果确实是稳定的，即相对于添加的RNA量而言，QPCR测量的转录本含量在所有样本中都恒定，那么这种内参是成功的，如果不是则还需继续寻找。爱荷华州立大学DNA facility主任Kevin Knudtson认为，即使有一种标准化内参，还是不够的，“至少有两个评价指标,才会对规范有效有更多的信心。”

2 RNA降解了吗？

密歇根大学医学院分子和行为神经科学研究所的研究人员Ilan Kerman，希望利用QPCR确认微列阵来源的基因表达的变化情况。Kerman的样本是人脑mRNA（采自于激光微分离出的一小部分细胞），不尽如人意。一些RNA提取于脑死亡和获取组织后的20到25小时内，RNA通常在这个时间段发生降解。“我们知道它们比常规手段处死的小鼠的RNA降解的要快。”另外， Kerman需要核实的基因表达量的变化范围为20－90％。

Toledo大学医学生理学博士James Willey认为，Kerman遇到的问题有两个：RNA降解和RNA含量太低。“就对RNA质量的要求而言，QPCR比其它现有的基因表达检测方法要低。”Willey在一封电子邮件中写道，“特别是设计小片段PCR扩增子（比如，不到150bp）”。另外，不同的基因降解速率不同。

Willey建议首先在凝胶中检测RNA的质量。“跑总RNA的电泳，如果两种核糖体条带能够完全分开，或者RNA完整值（RNA integrity number，RIN）很高（与安捷伦描述的一样），有可能得到可信的QPCR结果。如果不出现任何核糖体条带，或者RIN很低，为样本质量确立基因特异性标准就很必要。”至于RNA数量，他认为利用低量模板，随机采样误差会引起扩增循环数（cycle threshold，Ct）值出现大的变动。“高扩增循环数（比如，34或者35以上）有许多潜在原因，”比如低模板数和基因特异的抑制剂。区分这两个原因，他建议在每次分析过程中，加入一定数量的内参分子。

3 怎样检测低拷贝数模板？