定量PCR新技术报告之二：更准确、更安全的GeneXpert定量PCR一体机[选购宝典]

    继2003年SARS震惊世界后，2005年禽流感再度威胁人类，在亚洲地区引起不同程度的恐慌，谈鸡色变，并一次又一次重创国内的家禽养殖业。接二连三的传染性疾病威胁公众健康，对生物与医学领域的研究人员提出更高的挑战；一是如何快速准确地识别病原体从而找到合适的治疗方法，二是在已知病原体的情况下，如何快速准确判断各地疫情传播的情况，从而采取适当的应对措施避免扩散减少损失——这正是阻止“星星之火”发展为“燎原之势”的关键。

    挑战之一：如何在未知条件下更加迅速识别病原？SARS从爆发到被识别、测序仅费数月时间，已是医生和研究人员联手取得的长足进步。可时间就是金钱，就是生命。每拖延一天，就意味着公众健康面临更大风险。更快，是对研究人员提出的更高挑战。也许，需要世界各地疾控中心和医疗系统全部真正联网数据共享？也许，需要带有所有病原菌特征序列的实验室芯片或者定量检测试剂盒？也许，更好的方法藏在你心中等待你去发现。

    挑战之二：已知病原体的情况下，如何快速准确监控各地疫情传播状况？更快更准的新技术不断出现，比如定量PCR。相比传统方法，如今最快的荧光定量PCR，只要半小时左右就可以得到结果，速度快过免疫学反应，比起动辄2—3天的体外培养更显优势。定量PCR灵敏度极高，而探针法使得定量PCR结果的准确程度大大提高，即使在血清学反应微弱的疾病早期也能得到准确结果，因而日渐成为疾病监控的利器之一。

    但是，越是灵敏精密的实验，对操作要求越高。熟悉PCR的人都知道，PCR极高的灵敏度在某些情况下也成为PCR的“烦恼”，定量PCR也不例外。其中最容易出问题的，莫过于样本制备。人为操作可能会造成样品处理不当，样品被污染，对照出错等等方面的问题，哪怕一点点微不足道的失误都可能被几何级数放大，导致结果分析错误——即使操作正确，空气中的模版污染也可能导致结果出错！疫情监控需要当地采样当地检测以免耽误时间，较差的实验环境条件也令出错几率提高。平时普通的实验出错，大不了浪费时间，重来就是。可要是在疫情分析或者预报时出错，严重性可就大了！试想检测禽流感H5N1病毒，如果做出了错误的判断，那么这个方圆几公里的鸡禽类都会受到灭顶之灾，更不用说给人们带来的巨大的经济损失和沉重的心理负担了。

    此外还有一个很重要的考虑：安全性，由于是检测病原体，安全问题尤为重要。手工操作越多，检测人员直接接触病原体的几率越大，也就越危险。谁也不愿意重见SARS当年病人连累医生，研究人员将病毒带出实验室的悲剧重现。

    世界上第一个整合全自动样品制备和检测程序的实时定量PCR仪——来自美国Cepheid公司的GeneXpert快速检测系统是生物通编者非常推荐的一种解决方案。“Sample In. Answer Out”，是对GeneXpert最精辟的描述——直接加入采样样品，GeneXpert自动完成样品裂解、核酸纯化浓缩、定量PCR扩增检测，并输出分析结果，整个过程只需要30分钟！

    将样品处理制备和定量PCR过程整合起来全自动封闭完成，这不仅可以有效避免手工样品制备的失误或者试管开关之间可能造成的污染，大大简化了对操作的严格要求——事实上，你几乎不需要什么分子生物学实验技能就可以正确操作整个样品制备到定量PCR检测的过程，而且这种密闭整合的全自动反应，能更加有效保护检测人员安全。小巧紧凑而且低能耗的设计，令仪器便于携带并在各种环境下工作。仅仅半小时就能从采样的样本得到准确结果，在紧急关头，更显检测技术的飞跃。实际上，去年全美邮政系统已经广泛采用GeneXpert对付来自炭疽邮件的生物恐怖活动。

不算太大的旅行箱吧？灵活性无可比拟

    从样品核酸制备到定量PCR检测到结果输出仅仅30分钟，你想想就知道，这个被Small Times Magazine评为2005年度产品的家伙，绝非普通全自动核酸纯化+定量PCR的简单组合。事实上，Cepheid，这个由美国军方资助、以顶尖技术见长的公司，为GeneXpert投入了2大王牌技术，才使得GeneXpert有如此骄人的性能。

超前的样品制备系统：

    源自Cepheid公司的专利——microfluidic cartridges（微流样品管），这个cartridge有一个专利超声装置（sonic horn），用于破碎原始样品使内含的DNA释放出来；此外，一个用于转移液体的注射装置（syringe drive），联合一个用于搅拌样品的旋转装置（rotary drive），能将破碎后的样品在cartridge的各小室间转移，达到洗涤、纯化和浓缩DNA的目的，最后浓缩的DNA进入定量PCR反应管中，与定量PCR反应体系混合进行定量PCR反应，有效避免人为运送的失误和污染。这个cartridge听起来有点Lab-on-chip的雏形。

这就是microfluidic cartridges，左图那个突出的“尾巴”就是纯化浓缩后的DNA的最后目的地：定量PCR反应管。右图显示cartridge内部复杂结构。cartridge的实际大小，看看下图就知道
手持cartridge加样品，右为放入仪器中。

    另外还有一个独到之处，酶、dNTP、Buffer是浓缩在一个Beads中，而基因特异性引物、荧光探针、内参则包于另一个Beads中（最多可容4对引物和4条探针以进行多重qPCR）。一方面可保持样品和试剂在常温下的稳定，以及在cartridges中的快速溶解，另一方面也便于精确操作减少误差，使得同一反应在任何时候任何地点都可以得到高度重复性。

　

独特的PCR反应系统:  

    前面说过，荧光定量PCR极高的灵敏度有时也会带来一些麻烦——比如传统定量PCR仪的系统误差也会影响结果：比如96孔版上的边缘效应，由于每个反应孔位置距离加热中心的距离不同，各反应孔之间升温的速度难免有差异，如果不是96孔全负载反应而是有部分孔空缺，差异就更明显。对于需要参照的实时监控的定量PCR反应，这种孔与孔之间“不一致性”困扰就更加明显。严格的说，连发光器、检测探头距离样品的距离、角度不同都会造成结果偏差。如果你闭上眼睛硬要说这些都“无所谓”，那为什么那些仪器们都要注明这些参数呢？为什么有的定量PCR仪要设96个发光器呢？如果要问怎么不设96个检测探头，看看探头和LED价格的巨大差别，不用多说了吧。

    GeneXpertPCR反应的核心和Smart Cycler荧光定量PCR是同样原理的。以先进的模块技术赢得美国R&D TOP 100金奖的Smart Cycler扩增仪具有独一无二的优点：采用16个I-CORE模块的设计，每个样品槽都集成有自己独立的加热/冷却系统以及光学信号激发与检测系统，每个模块都可以独立的操控和运行，因此一台SmartCycler其实就相当于16台独立的定量PCR仪。这种独立温控设计，使得每个样品孔的温度控制仅受一个因素——模块的控制精度影响，精确程度达到了前所未有的高度；再加上每个样品槽独立的4—6通道荧光激发检测系统，扩展了应用空间，更令样品槽之间的温度差异和检测时光程差异可以忽略不计，你再不用担心整个荧光定量PCR反应和对照间的系统误差。同时也正是由于一套控温系统只服务于一只反应管，因此升降温速度都非常快：升温速度可达10℃/s，降温也达到了3℃/s，整个反应下来只需要20分钟就够了。此外，独一无二的独立设计使得模块反应之间互不干扰，所以非常适合于“来样即做”，或者同时进行多个反应程序不同的定量反应，比普通的梯度更加灵活；也省去了等待的时间，因此SmartCycler技术的精确性给GeneXpert提供了重要的质量保证和效率保证。（参考生物通定量PCR仪之选择宝典(2):各自精彩的选择）

　

内部质控：GeneXpert系统的优点就是整体反应在内部进行，防止了污染和人为错误，但是万一其中一步有问题，系统如何能自检从而识别错误来源，如何判断反应的准确性呢？GeneXpert针对这个问题设置了三个内部校对系统，从而保证GeneXpert系统反应的严谨性。

• 探针检测：这一步包括定量扩增前不同温度下多种荧光检测和程序内置参数比较。主要用于验证试剂微珠是否完全溶解、反应管中是否已经充盈、探针是否完整、是否有核酸酶或其他成分切割探针、探针的荧光染料是否稳定等。根据预设参数对比，能够及时发现潜在的错误。

• 内参：用和目的基因某种程度相似的模版作为内参，探针用不同颜色荧光标记（包含在Beads中），引物可以和目标序列相同或者不同，和目标基因一起扩增。主要用于验证反应体系中各组分是否正常工作——比如酶或者其他成分有没有降解、有没有扩增抑制物影响反应等等。

• 样品制备质控：可选择另外一种有独有基因的、不同于样本的对照本，不同颜色荧光标记的探针，引物，和样本一同进行处理、扩增，主要用于对样本制备进行质量监控。

    看了以上这些，不知大家注意数了下GeneXpert这个系统有多少专利了没有？GeneXpert技术统计下来一共有30多项专利，也难怪Small Times Magazine授予了GeneXpert“the best of small tech Awards”的称号。

    我们在这里可以总结出GeneXpert最主要的3大优点：

     1.更准确——独特的定量PCR反应设计降低仪器系统误差，从样品处理核酸纯化到定量检测的全自动一体化反应减少人为误差，全面的内参设计确保实验可靠

     2.更快速简便——30分钟全自动流程完成样品处理、核酸纯化浓缩到定量PCR检测

     3.更安全——全程反应均在全封闭条件下全自动进行，为操作人员提供更安全的保护，安全第一

应用前景：

    GeneXpert在全美邮政系统：估计300亿份邮件中进行了230多万次检测，没有假阳性，有18例“presumptive negatives ”可疑阴性（17例pX02+，1例pX01+），最后经过再培养被认定另外一种带有pX02变异的芽孢杆菌。

    GeneXpert不单在反恐和流行疾病监控能发挥重要作用，在临床检验也有可喜的前景，比如在孕妇中快速检测B链球菌感染、脑脊液中快速检测引起脑膜炎的肠道病毒、乳腺癌活检样本中快速检测癌症标志物（1期临床），白血病血液样本检测bcr-abl易位转录本残留等等可行性研究中均取得非常好的结果，无论准确性或者检测速度。相信随着研究的进展，GeneXpert的应用也会更加广阔。

局限：

    无人可及的准确性，安全性，快速，无疑是GeneXpert最大的优势。不过，看到这里，你可能已经看出GeneXpert的局限所在了——和所有qPCR/PCR反应一样，GeneXpert针对的仅仅是已知样品、已知基因的快速检测，对于不同的样品或者不同的检测目标，都需要研发人员预先研究和优化程序，专用的Beads化试剂会使得成本“相当”不小——包含样品处理、纯化、浓缩和定量检测反应在内，整个反应需要20刀以上——Cepheid的专家对此的回答是：在人命关天的时刻，有什么比检测人员的生命安全和整个社会的财产损失更珍贵呢？也是，就算不考虑GeneXpert能节省的时间和更准确可靠的结果，就单从研究人员/检测人员的安全防护成本或者万一感染需要治疗的费用上考虑，这个代价相对是低廉的。作为每一个实验人员，保护自己的安全第一，是至关重要的，鼓励为科学献身决不意味着可以不重视人身安全。无比昂贵的P3实验室不可能处处建，实验设备对操作人员的安全保护更值得重视。

    除了Roche的LightCycler和Corbett的3000系列，目前市面上的定量PCR都相当庞大——几乎不可能带着仪器到处跑，更别提定量和核酸纯化的一体化设计了。而我们前面提到过等待样品送到实验室检测是相当浪费时间的，因此，只有GeneXpert，可以提供这种便携性——你可以随时拖这个大手提箱去到各个地方工作，即使是纯粹的科研实验室，也可以很方便实现在不同实验室或者学校间共享，从而更充分利用这仪器——但是这也就带来了GeneXpert的另外一个局限：仅有4个样品槽——所幸这仪器平台可以进行扩展，前提是如果你愿意降低仪器的的便携性。无论如何，GeneXpert作为定量PCR技术的一种拓展延伸，还是非常值得你去了解和发现的。（生物通作者：薇安 张迪 ）