[新品推荐] Buster蛋白抽提试剂：大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞表达产物抽提首选

    无论是从大肠杆菌、酵母、或者哺乳动物细胞做胞内蛋白表达，或者是从细胞或组织中提取、纯化蛋白，首先要破碎样品才能抽提蛋白组分。常用的低成本的做法之一是超声波破碎。在这种相对剧烈的条件下活性蛋白质很容易变性，导致产物的损失，所以多见用于比较粗放的实验中，比如大肠杆菌包含体纯化。对于实验室一般较小规模的蛋白制备，特别是是细胞样品量有限的活性蛋白制备，Novagen的Buster系列蛋白抽提试剂是更好的选择。BugBuster、CytoBuster、YeastBuster蛋白抽提试剂，分别用于从大肠杆菌、哺乳动物细胞和酵母细胞中温和抽提蛋白。不需超声/高压破碎处理，可以温和、快速的破碎细胞，不使可溶性蛋白变性，尤其利于活性蛋白抽提。 NucBuster则特别为细胞核蛋白抽提而设计的。

BugBuster蛋白抽提试剂优点

• 从E. coli 中快速抽提可溶蛋白，条件温和，不需超声破碎或高压破碎等机械手段，尤其利于活性蛋白提取

• 操作简便快捷，产品可直接应用，且提供详细抽提步骤

• 非离子型去垢剂，破碎细胞壁细胞膜的同时不会引起可溶蛋白变性。

• 与Novagen提供的后继亲和纯化步骤兼容 

操作步骤：

• 离心收获菌体， 倒掉上清

• 菌体重悬于1/25体积的BugBuster试剂（最好加入Benzonase 核酸酶，可有效降低混合液粘度）

• 振摇孵育 （ 10 min）

• 离心，获澄清上清 （ 20 min），其中可溶性蛋白可直接上柱进行下一步的纯化，例如亲和纯化

• 如果离心沉淀里面有包含体，可以再用BugBuster重悬沉淀，用rLysozyme彻底消化细胞壁，并反复洗涤沉淀得到纯化的包含体，进行后继的变性复性纯化工作

Tips：

• rLysozyme有助于彻底消化Ecoli细胞壁，得到更好的抽提效果——在制备较大的蛋白时尤其推荐使用，但不是必要的。在pLysS等有表达T7融菌酶的菌株中更加不必使用。

• Benzonase 核酸酶可降解核酸，有效降低混合液的粘度，对后继离心和纯化都有帮助，强烈推荐共同使用。

• BugBuster可分为原液，无氨基酸型原液，10X浓缩液，HT即用型（预加2种酶），和分别配合两种不同酶的配套试剂，原液价格是926/100ml，可以处理2—2.5升细菌培养液（每5ml可处理1克沉淀的湿菌体，相当于100—125ml左右的细菌培养液）。由于非常有效地减少样品浪费的消耗，通常已经足够满足实验需要。2006年第二季度还有个75折促销，不到700元即可。考虑到使用的方便性，这个成本对于通常实验室的工作还是可以接受的。无氨基酸型原液主要针对的是后继实验准备做蛋白质固定化，交联等对氨基酸敏感的实验，用PIPPS代替Tris。10x浓缩液本来更划算一些，10ml/800左右（还没算折扣），可用自己想要的缓冲液稀释成100ml即用型原液。BugBuster可兼容Tris、PIPPS或者PBS体系，不过不适合用过酸性（〈pH5）或者NaCl浓度高于1M的溶液稀释，碱性溶液则OK。是否需要另外加酶或者要加哪种酶看自己需要了。

• BugBuster在使用过程中可以加入EDTA、DTT或者二硫苏糖醇、0.5 M THP [Tris(hydroxypropyl)phosphine]等还原剂，不过要注意EDTA会影响后继HisTag亲和纯化，而还原剂可能会激活蛋白酶。

• BugBuster在使用过程中可以加入各种蛋白酶抑制剂，不过也要注意，如果后继实验中融合蛋白需要用Thrombin, Factor Xa, 或者Enterokinase进行切割，避免使用丝氨酸蛋白酶抑制剂。

• 纯化的包含体可以用变性剂处理，直接上一些可耐受变性剂的亲和纯化柱，还可以用Novagen的 Protein Refolding Kit (Cat. No. 70123-3）中的溶解缓冲液处理，更简便的变性和复性。

订货信息
产品名称 规格 货号 
BugBuster™ Protein Extraction Reagent 100 ml( 70584-3)  500 ml( 70584-4)

YeastBuster

    酵母表达一般可以选择分泌表达，使得表达产物游离到培养液中，不单减少产物积累，也有利于纯化。不过分泌表达并不总是可行的，特别是对于其他丝状真菌乃至植物细胞，往往需要破壁处理。酵母的细胞壁不同于Ecoli，通常可用蜗牛酶或者β-1,3-glucanase进行数小时消化破壁得到原生质体。（蜗牛酶记得在上海生化所的试剂公司有售，很便宜，貌似在枫林路上，叫西巴斯，应该是上海生化所的英文缩写的中文读法，寒，很多人问这个）。YeastBuster则是采用还原条件下的去垢剂破壁，效率要高得多——只要室温15-20分钟（部分酵母要处理长一点时间，比如S.pombe）。同样，5ml的YeastBuster可处理1克湿重的酵母菌体，加入 THP，推荐添加Benzonase核酸酶降低溶液粘度。15-20分钟后离心除去不溶细胞碎片，得到的上清就可以用于后继的纯化实验，很方便。对其他丝状真菌乃至植物细胞YeastBuster同样可以大显身手。要注意处理过程是在还原条件下进行的，如果不适用还原条件就不能用这个Kit了。其优点和注意事项和上面介绍的差不多。反正温和快速高效就是最大的卖点。

CytoBuster 和 NucBuster

    在研究信号传导中激酶或者磷酸化酶，或者是研究细胞因子，或者要做免疫沉淀时，往往需要得到有活性的蛋白质，选择合适的裂解液就很重要，特别是哺乳动物细胞样品来源有限时。CytoBuster同样也含一种格外温和的非离子型去垢剂，操作上就更为简单，1.对悬浮细胞：只要离心收细胞，加入CytoBuster 5分钟；或者2.对贴壁细胞：除去贴壁细胞的培养基（如果有干扰后继蛋白质分析的成分，比如酚红就要用PBS或者HBSS多洗涤一次）加入CytoBuster 5分钟后用细胞刮子将细胞刮下集中到CytoBuster溶液中并收集到离心管里；最后离心取上清即可进行下步分析。不需要反复冻融，也不需要超声波，非常方便。这个试剂能与蛋白酶抑制剂、磷酸化酶抑制剂或者激酶抑制剂共同使用。50ml CytoBuster 裂解液价格在790左右（公开报价），用量呢？10⁶ 个悬浮细胞用量150ul，而6孔板/35mm皿用量为300ul左右，100mm培养皿用1ml左右。

    除了CytoBuster，新的NucBuster是专门为哺乳动物细胞核蛋白抽提做的——在EMSA（gel Shift）一类研究细胞转录因子的实验中需要用到细胞核蛋白抽提物以研究细胞因子和DNA的结合，过去细胞核蛋白抽提是件挺复杂的事，需要耗时7小时之久。NucBuster可将整个过程缩短为30分钟，先裂解细胞膜，去掉上清（细胞质成分），洗涤干净得到的细胞核沉淀再做下一步裂解。整个过程清晰简洁。有兴趣的读者可以致电Merck咨询。2700多人民币可以做100次细胞核蛋白抽提，每次不到30元——要知道买一个核蛋白抽提物可都得要1000多（SantaCruz的就要1700大元）呢！经常做EMSA的实在值得考虑。（生物通整理）