要解决SYBR Green的非特异问题，当然不是只有一条途径。所谓条条道路通罗马，不同于Qiagen或者ABI利用的是提高DNA聚合酶的特异性，“曲线救国”，Invitrogen公司采用直接改造SYBR Green的方法，发展出更特异更灵敏的荧光染料——SYBR® GreenER™ qPCR Reagent System。SYBR Green系列荧光染料由于低毒、灵敏度度优于EB而日渐受到科研用户的欢迎，这个原属于Molecular Probes公司的专利随着Probes被并购进入Invitrogen的大家庭，Invitrogen要优化它自然更方便啦。

    SYBR® GreenER™被Invitrogen称为新一代定量PCR荧光检测方法的核心技术之一，相比原有的SYBR Green，最大的优势的发光强度更强更明亮，使得原来检测不到的低丰度DNA的信号更容易被检测到——这也就意味着荧光染料的检测灵敏度提高了，从原来的0.1ng左右提高到6pg，应用在定量PCR检测中就使得基因表达数据分析更为可靠。此外，对荧光染料构造的修饰使得减少了染料分子对PCR反应的抑制作用。SYBR GreenER和原有的SYBR Green一样适用相同的滤光片，并不需要增加新的仪器或者新滤光片(filters)。SYBR GreenER可以看作是SYBR Green的兼容升级版了，具体的升级优化如下：

升级step one：快速反应与高灵敏度增加结果可靠性

SYBR GreenER这种新颖的DNA结合染料的一个显著特点就是在检测信号上有了大幅度提高，同时也由于SYBR GreenER消除了一些原有SYBR Green对PCR反应的影响（荧光染料结合入DNA小沟，阻碍扩增反应），因此反应时间得到了提升。而对于定量PCR反应来说，时间越长代表着反应越有可能进入平台期，影响数据分析，因此快速的反应也可以在一定程度上增加反应的可靠性（见下图）。

（通过对目标DNA的定量PCR扩增，可以从图中看出SYBR GreenER（绿色）比ABI SYBR® Green Master Mix (红色)，以及 ABI Power SYBR® Green Master Mix (蓝色)早3到4个循环得到数据）

同时也正是由于SYBR GreenER在检测信号方面的改进，因此灵敏度在原有的基础上又进了一步，可以百分之百检测到3pg gDNA（约一个人的基因组当量），而这在同类产品中可是是并不常见的（见下）。灵敏度的提高对于检测单拷贝基因是十分之重要的，尤其是对于稀有复制子，如果检测不到很有可能在疾病诊断和治疗方面出现纰漏，影响甚大。

（这里我们特别就这个问题咨询了来自Q厂家的专家Ivy，因为上表中Quantitect正是Q家花旦，Ivy表示，Quantitech可以检测低至5个拷贝的模版，用10pg模版也能得到非常漂亮的曲线（·“酶”头一蹙，计上心来 Qiagen vs.ABI(II)参考文中图片）（这里顺便插一句，我们常常看到厂家的宣传资料中有和其他品牌的对比实验，这些做实验的专家们一般只擅长做自家的产品，人家的产品做的结果都特不好，所以读者还是要自己多看多思考哦！）而且Q厂家认为光有灵敏度是不够的，定量的特异性更是非常重要的，Q的特异性是通过引物设计和试剂盒中的酶和缓冲体系共同来实现的。试剂盒的特异性体现在：使用同样的引物时，Q的体系反应仅得到特异性产物，但是其他同类产品的体系会出现引物二聚体(NTC曲线上升)，Ct值偏高。）

升级Step two：重复特异性

可靠的定量PCR数据来自于高度的特异性和可重复性，这也正是传统SYBR Green的缺陷所在，要改善这一点，SYBR GreenER除了采用了新型的这种GreeER染料，而且在混合液里的DNA扩增酶也进行了化学修饰，保证其在常温下不会扩增以及可以长时间4°C保存，这种热启动酶活性减少了非特异性扩增。另外SYBR GreenER也同样采用了UNG，减少污染。

这样得到的混合体系即使是模板量从6pg到1ng都可以保证阴性对照（NTC，no template control，即将目的DNA以水取代作为模板）的荧光信号都保持在40持平水平（见下），说明了这一混合液的高特异性和高重复性。

升级Step three：适合不同系统的多种选择

SYBR GreenER目前可以提供三种不同的体系以供选择，包括

• SYBR® GreenER™ kits for ABI PRISM® （包括 premixed ROX reference dye，获得对照）
• SYBR® GreenER™ kits for iCycler® （包括premixed fluorescein，获得动力学因子（dynamic well factors），可以用于参照）
• SYBR® GreenER™ Universal

（生物通专稿）