生物通定量PCR技术专题：荧光引物是在荧光探针的基础上发展而来的，基本原理就是借助荧光直接标记引物来监测扩增产物的生成，达到无需另外设计探针，节约成本的目的。最早获得荧光标记引物专利的是Serologicals Corporation（目前被Millipore收购）的Amplifluor，Amplifluor技术通过在引物上标记一个荧光发色基团和一个能量受体，利用与分子信标相同的原理获得与扩增产物量的增加成比例的荧光信号。虽然荧光引物法和SYBR Green一样仅靠引物专一性来保证产物的专一性，不过由于荧光标记在引物上而不会受到引物二聚体的干扰，因而专一性自然优于荧光染料法。    

    不过，生物通在这里着力介绍的是Invitrogen公司专利的荧光引物技术——LUX荧光系统。LUX（Light Upon eXtension）与Amplifluor技术不同，这是一种单标引物，也就是说它只有一个荧光基团（3’末端），那么这样如何能达到荧光检测的目的呢？首先，将定量PCR的一对引物中任意一条设计为带有末端回文结构，并在3'末端标记荧光素，这样，这条引物在游离状态下可形成发夹结构（茎环结构），而这种DNA构象本身具有淬灭荧光基团的特性，所以不需要在另一端标记淬灭基团。原来，LUX正是巧妙利用了发夹结构的DNA单链内在特性而节约了一个标记基团。当引物和模板配对的时候，这个发夹结果就打开，释放荧光，导致荧光信号显著增加，可以用机器进行定量（见下图）。

    这种设计和分子信标挺相似，而优胜之处在于，1.用引物代替探针，无需设计探针和合成，经济节约；这个发夹引物设计也比分子信标探针更为简单——我们知道分子信标的主要难题是，探针匹配的是基因内部序列，不一定能在每个基因上都能找到长短适中且带有末端回文结构的序列，所以分子信标的探针设计不容易；而引物就不同，在引物5'端额外添加几个和3'配对的碱基并不困难，因此从理论上来说引物设计就相对容易。2.就是前面提到的，只需要标记一个荧光基团，更为省事节约。当然，从理论上来说，荧光引物法的专一性不如探针法，而从实验结果的角度上来看灵敏度相当不错，可以检测低至10个拷贝的基因（检测7个数量级范围的动态变化），和Taqman相当，可以满足一般实验的特异性要求，也正因为这个原因，LUX比较适合于保守序列的分析，进行突变检测。

 

    由于是荧光标记引物，LUX还可以进行熔解曲线分析。熔解曲线分析是一种简单直接的检查实时PCR反应引物二聚体和污染的方法，以确保反应的特异性和精确的定量。虽然 LUX荧光引物在扩增的过程中不断消耗，荧光的产生是不可逆的，检测的是积累荧光，这一点和Taqman法一样，不过应该借助过量的荧光标记引物，在反应结束后依然可以进行熔解曲线分析，可以很容易地确定没有引物二聚体或者污染，从而获得更多的样品信息。

    除了高灵敏度，中特异性和低成本，LUX还有一项被Invitrogen反复称道的优点，那就是在多重反应中的作用，多重反应（Multiplex）可以帮助研究者在一管中进行2个或2个以上的基因的检测，这对于对照意义特别重大，因为只有在整个缓冲条件和温变条件一致的前提下，对照才有意义。LUX可以同时检测多达3个不同目标的检测，对于单荧光标记引物而言是容易实现的，但是也要指出目前LUX只有很有限的几种荧光标记：FAM（6-羧基-荧光素）和JOE标记（6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素），和Alexa Fluor 546。

    LUX的优点容易理解，但是疑虑还是有的：比如结构淬灭是否完全？背景如何？这种发夹结构淬灭，是否和G淬灭（就是临近的G碱基会增强荧光淬灭效果）原理相似？发夹结构状态下的荧光强度和变性打开、到引物延伸合成这3步之间荧光信号的变化如何？为什么目前可应用的荧光标记只有3种？是因为发夹结构不足以淬灭其他荧光基团？一个发夹结构的引物和一个对应的普通引物之间是否比较不容易形成引物二聚体？由于生物通手头资料有限，某些问题还没有找到令人信服的答案，也许我们生物通的读者能给我们一些启示？LUX引物一般为20-30个碱基，内部形成发夹结构，在设计LUX引物的时候其实把靶基因序列呈递上Invitrogen公司（http://www.invitrogen.com/lux），或者下载相应的软件就可以得到标准的引物序列。由于这个过程是通过软件完成的，因此受到人为的影响教小，简单易行。

    而有关结构淬灭，Invitrogen的技术人员通过检测一级结构对于内部标记寡核苷酸和5’，3’末端标记寡核苷酸荧光强度的影响，也通过单链和双链寡核苷酸详细研究了二级结构对于荧光强度的影响。结果发现荧光强度实际上取决于寡核苷酸的二级结构、荧光基团所处的序列框架以及荧光基团和寡核苷酸3’或5’末端的相邻距离，而这一方面也得到了实验的证明，见下。另外LUX在特异性方面会比SYBR Green荧光染料高的原因之一就是在于其不会形成引物二聚体，LUX可以进行溶解曲线的分析，这就可以方便快捷的检测是否有引物二聚体和污染了。

荧光强度随着荧光基团与寡核苷酸3’末端的距离而变化。较短（蓝色▲）的那段序列（假定为一段LUX™引物序列）由于其自身的荧光淬灭性能导致其表现出较低的荧光强度。而当这段序列就象是在PCR过程的延伸反应中一样被延长（红色●）后，就丧失了其自身的荧光淬灭性能，荧光强度也就增加了好几倍。

兼容机器   

    目前Invitrogen提供的LUX标记引物设计50nmol的浓度大约是1100元到1400元（不同的标记价格不同），当然也可以自行合成标记引物，而厂家推荐使用的定量试剂盒还是Invitrogen的Platinum定量PCR试剂盒，这个试剂盒不是用生物通前面介绍的最严谨的热启动PCR酶，而是采用UDG技术（用dUTP代替dTTP，UDG酶降解第一轮95度变性前合成的非特异产物，然后用95度将酶灭活）。100次反应（50ul体系）是2500多块，由于包装不大，并不是十分昂贵。可以这么说，LUX比SYBR Green专一性高、贵一点、麻烦一点，又比探针法便宜、简单、专一性稍低一点，因此也是进行定量PCR反应又一种不错的新选择哦。

以下是来自Invitrogen公司的比较。

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