建立高通量实验室第一步:高通量质粒DNA提取方法[创新技巧]

【字体: 时间:2006年06月16日 来源:生物通

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要知道,为了保持现在的位置,我们需要尽竭尽全力去奔跑。如果你想要奔跑得更高,那么你需要两倍的速度。

     ——Lewis Carroll,小说《Through the Looking Glass》 (London, Macmillan, 1872)


    现今的实验室管理者所要面对的一个新增的重要问题就是实验室数据大批量生产问题,这个问题也就是高通量问题,而要建立一个高通量实验室,大批量低成本,高效率的质粒DNA提取是保证条件之一。以下我们将会告诉大家在预算有限的情况下,如何建立一个每天需要进行数百次质粒DNA制备的中等水平实验室,以及如何选择高通量系统的标准。

    20世纪80年代,高通量(high-throughput,HT)质粒制备简直令人无法置信, 48次制备需要长长的一天时间,结果可以使得移液的手抽筋。今天,一天内从数百个样品中高通量提取质粒DNA,在具备需要96孔微型平板的自动手工高通量系统的条件下,提取数千个样品,这些已经成为了可能。在移液步骤中加入自动液体处理系统的帮助即能实现半自动化,而在全自动系统中只需将培养物上样,之后的步骤可以自动进行。但假如需要大量的质粒DNA,由于微型(或者更大的)离心管的限制,这种手工高通量制备方法是不可行的。 

Mini Prep Course

    理解质粒提取的化学原理可以帮助研究人员协调数量与质量之间的关系。
    质粒是由肉汤培养的含质粒的细菌中提取而得。这首先需要裂解细菌,最常用的方法是用碱与SDS或者非离子去垢剂处理。细胞裂解还可以通过在过程中加入溶解酶得到增强。下一步就是进行质粒DNA与蛋白质和其它核酸中的分离——这是高通量制备法最难的一步。

    在经典的方法中,细菌基因组DNA在高pH的情况下被选择性地变性。随后的中性状态下,在裂解中遗留了SDS的情况下,细菌DNA和其它细菌残骸、一些RNA和蛋白一起沉淀,将质粒DNA留在上清中。质粒DNA可以通过不同的沉淀方法进行进一步的纯化,如用聚乙二醇沉淀或者用有机溶剂进行抽提,然后选择性地用无水乙醇或者异丙醇进行沉淀。

    几种固相纯化方法手册也是具有参考价值的,它们或是利用柱子,或是利用滤器。尽管Edge Biosystems的试剂盒利用羟化聚合物(hydroxylated polymer)结合杂质,大部分方法将DNA结合到固体基质上(solid matrix)从而去除杂质。可用的基质材料包括玻璃、毛料、硅、硅藻土(或者纯的氧化硅 ) 、Sephacryl S-500和磁珠。

    一种进行特异性结合新颖的方法利用了三螺旋亲和力(triple-helix affinity)来捕获DNA。这种技术利用具有亲和力的基质与小寡核苷酸偶联,这种小寡核苷酸的氢键可以与双链的质粒DNA的主沟的唯一的位点结合。这种方法可以用来制备基因治疗级别的质粒,并且可以量化制备的产物;该原理同样在更小量的高通量提取系统中同样适用。基质的结合特性可以通过改变洗涤或者冲洗缓冲液,或者化学修饰来调整。RNA和内毒素可以通过质粒DNA与以上的任一种固体支持物结合而去除。最后的步骤是洗脱,通常需要离心,尽管也有用真空系统抽提进行。


Choosing a System

    20多年前,Joe Sambrook等提出任何一种质粒提取方法均可以得到改进,今天这一预言得到实现。利用与96孔平板相同的方法,一批12个左右的微型离心管一起工作通常可以改进提取方法。在每个实验室程序中,许多因素需要考虑,例如:下游应用、预算、空间和使用的容易程度等。预制试剂盒具有预知时间和费用的优点,并且通常简单易用。作为长期使用,在人们看来这些试剂盒可能较昂贵——大概1-2美元每个样品,但较省时——这使得它们值得考虑。

    当选择一种高通量提取系统的时候,需要考虑所提取的质粒的用途。转染实验需要最高级别的纯化质粒,大部分试剂盒与公开的高通量制备方法提供的纯度的质粒可以用于这一方面。在纯度要求的另一角是是PCR 和DNA 测序——它们要求的纯度不高。如果技术人员仅仅是测序一个鸟枪法文库的插入片段,然后检测克隆序列,那么没有质粒预先制备可能是可行的。

    纯度是一种关于杂质与污染物相对含量的表述。杂质包括:细菌DNA、RNA、碳水化合物与内毒素。而污染物是一些在提取过程中加进的物质如:溶剂和配体。试剂盒的优点是供应商已经注意到质量监控问题。然而在寻找最好的提取系统中仍然存在着许多变数需要进行实验测试。例如,宿主细菌菌株系与质粒的不同组合会导致产生不同水平和不同类型的杂质影响提取系统。另外一个需要考虑的是废料处理问题——尽管会使用更小的体积,固相系统和更少量有毒有机溶剂。

Look Ma, No Hands

    假如数小时的令人眩晕的移液操作让你疲倦的话,那你可以考虑一下自动化。自动化程度的范围可以从每天设定程序和偶尔干预(离心或者补充试剂)的系统到全自动运行整个操作步骤的系统,可以使得技术人员抽出空来进行其它工作。在不同程度的人为干预下,大部分自动系统可以一天内进行超过1000次的质粒提取。

    两种可供选择的自动化策略是:标准组件型(Modular systems)和专门型系统(specialized systems)。标准组件型系统具有多功能并且能够通过设定程序可以执行几乎包含移液在内的所有重复性任务,但问题在于利用同一自动系统不能进行不同提取的操作。绝大部分这类系统处理应用96孔平板和384孔平板。一些仪器甚至可以容纳1536空平板,在这种规模下,所用的试剂体积十分低(次微升级),出于流体动力学的考虑,使得一些步骤较难进行。由于这些自动系统在很少或者没有监管的条件下进行运作,它们可以处理许多平板,使得平板设计基本上不是一个限制因素。(生物通:亚历)

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