Nature Review:miRNA,microRNA(3)[创新技巧]

Nature Review:miRNA在肿瘤中的作用，应用前景

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与MYC 癌基因有关的miRNAs
    MYC 癌基因，编码一个基本的转录因子，在人的肿瘤样品中常常有突变或者表达增加，并且这一基因也被证明是一个细胞生长的重要调节因子，因为其能够诱导细胞增殖和凋亡。有趣的是，miRNAs 和MYC 的表达增加有着紧密联系，并且这会导致B 细胞的恶性增殖。例如，当MYC 异位到mir-142 位点会导致一种侵入性的B 细胞白血病。这种异位导致MYC位于miRNA 的发夹结构的下游，其转录受到miRNA 启动子的控制。当MYC 异位到这一位点后，使得miRNA 前体分子下游的20 个核苷酸保守区域的丢失，破坏了miRNA 的加工，导致MYC 表达上调，并引起B 细胞的转化。

    另一个miRNA，miR-155，也和MYC 在B 细胞中的高表达有关。这个miRNA 是由BIC 基因的241-262 核苷酸编码的。这个基因最初发现是禽类白血病病毒的整合位点，而后发现在B 细胞淋巴瘤中过表达。数年间，研究人员感到困惑，这种非蛋白编码的在禽类、小鼠和人的基因组中并不保守的RNA 是如何促进淋巴瘤形成和MYC 表达的。Metzler 等人发现，在BIC 上具有一段138 个核苷酸的保守序列，编码了mir-155 的发夹结构。该研究组还发现在儿科Burkitt 淋巴瘤中，表达量上升了100 倍，此外的研究也发现，Hodgkin 淋巴瘤等肿瘤中miR-115 水平也有提高。因此，mir-115 可以作为一个癌基因和MYC 协同作用，而其正常功能是在B 细胞的选择中起作用，其可能的靶基因是那些对抗MYC 信号通路的基因。

    在乳腺癌中也有报道miR-155 上调，这预示着这个基因在血液系统外也有功能。而且，mir-115/BIC 基因的结构类似于mir-15a 和mir-16-1 基因，这是由非编码蛋白的LEU2 基因的内含子部分编码的，另外，C13orf25 的情形也是类似的，其上含有mir-17-92 基因簇。不过一个非编码蛋白的包含miRNAs 的转录本和肿瘤发生之间的关系还不是很清楚。He 和O’Donnell 等人最近发表的两篇论文更直接的描述了miRNAs、MYC 和癌症之间的关系。在散布的B 细胞淋巴瘤、滤泡型淋巴瘤、套细胞淋巴瘤等肿瘤中常常13q31 位点的扩增。而在这一扩增区域的唯一的基因就是一个非编码蛋白的RNA，C13orf25，这个转录本编码了mir-17-92 基因簇，其中包含了7 个miRNAs：miR-17-5p，miR-17-3p，miR-18a，miR-19a，miR-20a，miR-19b-1，and miR-92-1。He 和他同事分析了具有13q31 扩增的细胞系的191 个miRNAs，发现其中有6 个miRNA 的表达增加，其中5 个属于mir-17-92基因簇。此研究组还发现，在65%的B 细胞淋巴瘤细胞样品mir-17-92 的前体分子表达增加。他们由此推断，这个基因簇的过表达与肿瘤形成有关。

    为直接检验这一假设，研究人员利用一个逆转录病毒系统在带有Myc 转基因的小鼠血细胞(HSCs)表达mir-17-19-b1(mir-17-92 基因簇的一部分)基因簇。野生型小鼠接受了一个亚致死剂量的射线照射，去除所有的骨髓细胞，然后移植那些逆转录病毒转染的HSCs。移植了带有mir-17-19-b1 基因簇和Myc 的HSCs 的小鼠更快的发育成恶性淋巴瘤（约51 天），而移植了仅含有Myc 的HSCs 的小鼠需要3-6 个月。并且，过表达Myc 和其他单个的96无关的miRNAs 或者单个的mir-17-19-b1 基因簇成员并不能加速肿瘤发生。过量表达Myc和mir-17-19-b1 基因簇miRNAs 的淋巴癌与仅有Myc 过量表达肿瘤相比较，具有更强的增殖能力，更低的细胞死亡率。

    这些实验证实，mir-17-19-b1 中的miRNAs 可以协同地行使癌基因的功能，可能是由于其靶基因是在MYC 过表达条件下激活的凋亡因子。当凋亡途径被去除，MYC 可以诱导细胞不受控制地增殖，这导致了肿瘤发生。mir-17-92 基因簇的癌基因的功能也在其他肿瘤病例中得到证实，miR-19a 和miR-92-1 的表达水平在B 细胞CLL 病人的肿瘤细胞中上调，mir-17-92 基因簇中的miRNAs 在肺癌中过表达，C13orf25 在腺泡状横纹肌肉瘤和脂肪肉瘤也有扩增。

    O’Donnell 等人单独证明了mir-17-92 基因簇是一组可能的肿瘤相关的基因。他们利用含有235 个人类、小鼠、大鼠的miRNAs 芯片筛选在过表达MYC 的人的B 细胞系P493-6中表达发生变化的miRNA。他们发现MYC 诱导了mir-17-92 的表达，染色体免疫共沉淀实验表明，MYC 结合于C13orf25 第一个内含子区域，这说明MYC 直接调节了mir-17-92pri-miRNA 的转录。下一步需要鉴定受MYC 调节的这个基因簇的靶基因。以前的生物信息学研究表明，转录因子E2F1 是这个miRNA 基因簇中两个miRNAs（miR-17-5p 和miR-20a）的靶基因。E2F1 通过调节DNA 复制、细胞分裂、凋亡相关的基因控制了细胞从G1 期到S期的转换。

    有趣的是，E2F1 可以正反馈调节MYC。O’Donnell 等人还发现，在一株子宫癌细胞株中抑制mir-17-5p 和mir-20a 可以显著的提高E2F1 的表达，并且这一过程并不影响mRNA的含量，这是miRNA 介导的基因抑制的特点。相对野生型的E2F1 3’UTR 报告基因载体而言，对于E2F1 3’UTR 的miR-17-5p 和miR-20a 互补位点的突变可以导致报告基因的活性增加。综合起来考虑，这些研究说明MYC 可以诱导E2F1 和mir-17-92 的转录。而这些miRNAs 可以抑制E2F1 的翻译。因此，MYC 对于细胞生长的调节是通过mir-17-92 基因簇严格控制的。在MYC 存在的情况下，mir-17-92 基因簇中的miRNAs 限制了E2F1 的活性，通过阻断MYC 和E2F1 的正反馈循环削弱了MYC 对于细胞增殖的影响。在这一模型中，mir-17-92 基因簇所起的作用是抑癌基因的作用，这与上面讨论的He 等人的发现是相反的。

    与这一模型一致的是，O’Donnell 和同事还发现，在肝癌中也有编码mir-17-92 的13q31 位点的丢失。然而，尽管E2F1 可以促进细胞增殖，但是当E2F1 的表达水平超过一阈值，它也可以引起凋亡。在此情况下，miRNAs 对于E2F1 的负调控可能是通过阻断E2F1 的诱导凋亡活性，促进MYC 介导的细胞增殖，支持了He 等提出的模型。mir-17-92 基因簇的抑癌基因和癌基因的多重特点表明了肿瘤发生的复杂性和miRNAs调控基因表达的复杂性。这些结果也反映出单个的miRNA可以控制许多不相关的靶基因，导致其可以控制细胞增殖、细胞分化之类相反细胞活动。mir-17-92 基因簇起抑癌基因和癌
基因的作用可能依赖于表达这些基因的细胞类型和组织，还与受到调控的特定靶基因有关。未来的研究可能发现，miRNAs调控多个肿瘤相关基因如BCL2，Ras和E2F1。实际上，Felli等人最近发现，miR-221 和miR-222 通过下调KIT癌基因来调节CD34+ HPCs生成红细胞并且抑制TF-1 细胞系的生长。He等人在原发性甲状腺癌中发现KIT转录产物和蛋白水平的减少，miR-221，miR-222，和miR-146 的表达增加，这也暗示着在这些环境中，这些miRNAs具有癌基因的作用。在10 个原发性甲状腺癌病人中有5 个在KIT与miR-221、miR-222 和miR-146 互补的位点有点突变，这导致了miRNAs与靶基因的相互作用的改变。对于这些miRNAs如何通过下调KIT癌基因促进肿瘤发生需要作进一步的研究。因此，miRNAs可能用作多种肿瘤治疗的药物靶点。

miRNA 表达谱可能帮助肿瘤诊断
    Northern-blot 和芯片可以用来确定组织特异性的miRNAs 表达。在特定的器官中观察到的独特的miRNA 表达谱证明了发育过程中miRNAs 在干细胞的维持和引导细胞分化中的重要作用。研究人员现在开始使用miRNA 表达特征来对肿瘤进行分类，并且确定那些可以用来估计预后的miRNA 标记。

    Lu 等人研究发现，相对较少的miRNAs（约200 个）表达谱就可以对人类癌症进行分类。他们设计了一种基于微珠的流式细胞技术的新方法来研究正常和癌症的miRNAs 的表达。多种组织来源的肿瘤通过miRNA 表达谱进行归类，最终发现这些结果与肿瘤组织的胚胎来源一致。例如，内皮起源的如直肠、肝、胰腺、胃癌被分成一类，血液系统来源的也被归为一类。有趣的是，利用大约16000 编码蛋白的mRNA 表达谱对同一批样品进行分类，分级聚类分析却不能得到一致的结果，例如，胃肠来源的肿瘤不能被分到一类中。因此，肿瘤的miRNA 表达特征反映了其发育起源，这也与miRNAs 指导组织特异性发育功能相一致。

    研究人员还比较了正常组织和肿瘤样品的miRNA 表达谱，发现217 个miRNAs 中的129 个表达水平在肿瘤中下降，这与组织无关。因此，整体来讲，miRNAs 可能与细胞进入分化程度更高的阶段有关，肿瘤和正常组织的miRNA 表达谱差异代表了这些细胞的分化水平的差异。这些研究确定了miRNAs 为“oncomirs”，暗示异常的miRNA 表达可能导致去分化，引起肿瘤发生。

    一个确定多种肿瘤的miRNA 表达谱特征库，可以帮助诊断和治疗肿瘤。由于miRNAs可以从福尔马林固定的石蜡包埋的样品中分离出来，这使得miRNA 表达谱特征库建立成为可能。某些特定的miRNAs 表达差异已经被证明可以用于精确的预测病人的预后。从治疗的角度，miRNA 表达谱可能为临床上确定一个治疗方案提供一个强有力的工具。例如，Lu等发现，miRNA 特征可以成功地对于组织学上难以诊断的癌症样品进行分类。

未来使用miRNA 作为治疗手段
    miRNAs 具有重要的肿瘤抑制基因的功能，可能会对肿瘤的基因治疗产生很大的影响。类似于上面比较肿瘤和正常组织的miRNA 水平的方式，进行大范围的miRNA 表达扫描，可以鉴定肿瘤有关的新的miRNA。Cheng 等设计实验对miRNA 进行功能扫描，确定那些特异性的控制细胞增殖、凋亡的miRNA 基因。未来，引入与具有癌基因特性的miRNA 互补的合成的反义寡聚核苷酸——抗miRNA 寡聚核苷酸（AMOs）——可能有效的灭活肿瘤中的miRNAs，延缓其生长。临床上，可以通过经常的或者持续的2’-O-甲基化或者锁核酸（LNA）等修饰的反义寡聚核苷酸给药使miRNA 失活。这些修饰使得寡核苷酸更稳定，比其他治疗手段毒性更低。

    使用antagomirs（与胆固醇偶联的AMOs），注射小鼠后可以在不同器官有效抑制miRNA 活性，因而可能成为一种有希望的治疗药物。相反的，过表达那些具有肿瘤抑制基因作用的miRNAs，如let-7 家族也可以用于治疗某些特定的肿瘤。利用病毒或者脂质体的表达系统可以瞬时引入大量miRNAs。这些技术可以保证在某些组织特异性的启动子控制之下，表达pre-miRNA 及其两侧序列，并且刺激内源性的miRNA 加工，产生正确的miRNA，抑制特定基因表达。然而，利用这种类似于用于肿瘤治疗的siRNAs 方法，免疫反应可能会限制RNA 的有效运送。miRNA 治疗从实验室到临床应用的过程中，还需要进一步的发展这些方法。miRNAs 是否能够成为神奇的子弹仍然需要时间的考验，但是，这一领域的研究毫无疑问将会增进人们对肿瘤发生机制的了解。（完）
康成生物供稿