RNAi实验4个要素和基本实验路线[心得点评]

总结RNAi实验的4大要素和3种实验基本路线

    RNA 干扰是一种自然发生的基因沉默机制，应用于基因功能研究和临床疾病治疗，就成为一种功能非常强大的工具。不过，开展RNAi实验并不难，不需要特殊的仪器，RNAi实验所需的4大要素一点不复杂：

• 对应目标基因的dsRNA(siRNA,长dsRNA，shRNA载体,看实验需要）；
• 适合的转染或者其他将dsRNA递送进入细胞的方法；
• 适当的对照；
• 检测目标基因表达情况的方法

1. 对应目标基因的dsRNA
在非哺乳动物细胞中，直接向细胞导入长双链RNA(dsRNA)，在细胞质核酸酶Dicer的作用下可将长双链RNA降解为21-23bp的小分子干扰RNA(small interfering RNAs，siRNAs)，这些小分子RNAs结合其他元件形成“RNA诱导沉默复合物”(RNA-induced silencing complexes，RISCs)，并引导RISCs结合到与之互补的mRNA序列上，降解对应的mRNA， 从而导致对应蛋白质水平下降，最终导致目标基因表达沉默(见下图：线路1，蓝色

    对于哺乳动物细胞来说，导入30bp以上的长双链RNA(dsRNA)往往会诱发非预期的抗病毒应答反应，此路不通。所以常见的做法是直接制备19-23bp左右的siRNAs，将siRNAs转入哺乳动物细胞(线路2，红色)；或者是将短发夹结构RNA(short hairpin RNAs，shRNAs)的DNA表达载体转入细胞，表达产生shRNA，经过Dicer切割后得到siRNA(线路3，黄色)；最后siRNAs同样和其他元件组合成为RNA诱导的沉默复合物RISCs，在siRNA指引下识别对应的mRNA序列并降解mRNA，从而使特定基因表达沉默。线路1和2均为诱发瞬时基因沉默，持续时间约3－7天，根据目标基因而异，shRNA表达载体则可以建立长效基因沉默的细胞株，进行功能缺失基因组筛选研究，也可用于体内RNAi研究。
市面上提供RNAi试剂的厂家越来越多，产品也格外丰富，如何选择呢？生物通参照这3条主要的RNAi实验线路的每个步骤，分别汇集介绍市售好用的相关产品，方便大家实验时作为选择的参考。

2. 适合的将dsRNA递送进入细胞的方法
一旦拿到siRNAs或者dsRNA，还需要一种将双链RNA传递到细胞里的方法。传递的方法因细胞种类不同而异。对于线虫之类的低等动物活体进行体内RNAi实验，多见以喂饲或者浸泡方法将dsRNA导入体内。体外培养细胞，多数的贴壁细胞可以用脂质体或者多胺类试剂来进行有效的转染；对于原代细胞或者悬浮细胞，如果常规转染方法不行，可以用电转，甚至显微注射等，或者通过病毒载体感染等方法进行，病毒载体还可以作为哺乳动物体内RNAi实验的手段。

3 设置适当的参照
生物通RNAi实验特别ebioTips1：
 设置好参照：适当的参照对于每个实验来说都是关键的，必须的，非常重要的。RNAi实验也不例外。缺少适当的参照，RNAi实验的结果就无从分析。
 未转染细胞对照：不加转染试剂的空白对照，用于排除转染试剂对细胞活力的影响（这个可以在摸转染条件时先做）
 空白对照：只加转染试剂(如果实验用到载体则可做一组空载体对照)，用于排除siRNA转染对细胞活力的影响
 负对照：设置不针对目标细胞内源任何基因的siRNA对照，用以排除转染siRNA对基因表达可能造成的任何非特异影响。
 正对照：设置针对易于检测的参照基因的siRNAs，用于确证siRNAs的递送、转染以及反应条件环境是可行的。也有建议选择和目标基因同一信号通路的另一个基因作为参照，便于排除脱靶等副反应，以及进一步确认目标基因的功能。
 好的实验设计应该选择至少2个以上针对同一目标基因的有效siRNAs同时平行做实验，以相互验证实验结果确实是由于目标基因沉默而引起的，并非个别siRNA的特异现象。
 可选：荧光标记的siRNAs对照便于检测siRNA递送效果（节选）

全文链接ebiotech专刊之《RNAi 5年回顾及技术宝典》