严防死守RNase[心得点评]

【字体: 时间:2007年11月06日 来源:生物通

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  介绍防止RNAse污染的有效方法和注意事项

    虽说有的RNAi实验过程可以不涉及RNA,比如用载体表达shRNA,可是涉及RNA合成,后继的RNA纯化和定量RT-PCR,还是和其他涉及RNA的实验一样要求严格避免RNAse污染。痕量的RNase就可以严重破坏实验结果,不可不防--
 
    实验用到的试剂和耗材如指管和移液枪头都要求是无RNase污染的,或者DEPC处理过的(注意含Tris的溶液不能直接用0.1%DEPC处理,详见Tips)。戴手套,不小心接触各种表面后,比如桌面啊,冰箱把手啊,门啊什么的,要勤换手套。

生物通ebioTips 3:DEPC(Diethyl pyrocarbonate)是强RNAse抑制剂。0.1%DEPC处理溶液或者器皿表面,可以通过共价修饰使RNase失活。DEPC按照0.1:100的比例加入试剂中,37度保温12小时,高温消毒15分钟可以除去DEPC残留,最后得到DEPC处理过的溶液,这个浓度对于一般的实验室内去RNase污染处理已经足够,对于RNase特别高的溶液则可能需要提高DEPC处理浓度。但是DEPC会和Tris的氨基反应而降解,失去灭活RNase的能力,所以不能用0.1% DEPC直接处理含有Tris的溶液。通常可以改用DEPC处理过的水来配置Tris溶液。已经配好的含Tris的溶液,可以用1%的DEPC处理以灭活RNase。不过过高的DEPC残留可能会影响后继实验。

生物通ebioTips 4:溶液残留的痕量DEPC会通过羧甲基化修饰RNA嘌呤基团,羧甲基化修饰RNA在无细胞体系中翻译效率非常低。不过除非大量的嘌呤基团被修饰,通常这种羧甲基化修饰RNA和DNA或者RNA之间的杂交性不受明显影响。所以,对于0.1%的DEPC,一定要100度加热处理15分钟以上去除溶液中的DEPC,再进行RNA相关实验。(节选)

    DEPC溶液主要用于处理容器和溶液中的RNase,对于工作台,加样器等较大面积的表面处理,一些去除环境中RNA酶污染的辅助产品更加适合,虽然不是必需的,可要帮助实验室严防死守RNase,还是挺好用的。RNA干扰属于探索性的研究,万一得不到预期的结果,到底是由于环境污染破坏还是由于实验设计上的问题,分析起来可就麻烦了,因小失大,耽误文章发表,甚至丢掉唾手可得的成果,岂不冤哉?
Ambion公司的RNaseZap和RNaseZap Wipes:一种含有3种有效成分的溶液,接触表面同时就能立即灭活RNase,对于不适宜烘干或者消毒的表面处理,比如工作台桌面,加样枪表面,或者其他玻璃表面、塑料表面,非常方便,喷一喷,擦一擦,轻轻松松除RNase。

    RNaseZap还可以用来处理指管表面,去除RNAse污染的同时也不会残留影响酶切反应的残基。RNaseZap有多贵?250ml要825(不能稀释的),4升7722人民币(2007年公开报价)。Wipes就类似浸透RNaseZap的湿巾,一筒100张,报价908。每次揪一张出来,直接擦拭表面就行,特方便,特适合工作台,加样枪,手套,门把手,电泳槽什么的。3筒补充装要2063。用一次要6块多到9块钱,不过与其出了问题花更多的试剂和精力去重复劳动来弥补漏洞,还不如一开始花费少点来预防。

生物通ebioTips 5:如何维持实验室无RNase污染?
• 经常定期处理各种表面,防止RNase污染。
• 实验全程戴手套,一旦手套触及其他
• 表面立即更换。
• 加样枪专用,
• 选择无RNase污染的指管枪头和试剂
• 减少RNA实验区通风或者空气流动

全文链接:生物通ebiotech专刊之《RNAi 5年回顾和技术宝典》

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