非哺乳动物细胞体系的RNAi实验和选择[选购宝典]

【字体: 时间:2007年11月06日 来源:生物通

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  低等生物和植物,由于不涉及抗病毒免疫应答反应,通过体外转录即可制备目标基因的dsRNA(通常200bp或以上),直接用长双链RNA进行RNAi实验,不需要另外设计siRNA,因而比较简单。长双链RNA的制备很容易,省掉了设计合成单个siRNA的麻烦,并且长双链RNA在生物体内会被Dicer酶降解为多个siRNAs混合物,因而往往比单个siRNA更有效。

    比如果蝇,线虫,拟南芥等低等生物和植物,由于不涉及抗病毒免疫应答反应,通过体外转录即可制备目标基因的dsRNA(通常200bp或以上),直接用长双链RNA进行RNAi实验,不需要另外设计siRNA,因而比较简单。长双链RNA的制备很容易,省掉了设计合成单个siRNA的麻烦,并且长双链RNA在生物体内会被Dicer酶降解为多个siRNAs混合物,因而往往比单个siRNA更有效。长链dsRNA的递送方法依细胞种类而异,果蝇培养细胞转染、饲喂或者浸泡线虫、乃至显微注射等方法均可将dsRNA递送到目标细胞。dsRNA得到的是瞬时基因沉默。

体外转录:
    常规的体外转录试剂盒通常是为体外转录合成单链mRNA而设计的,你可以分别合成2条单链RNA,再合并退火。不过你也可以将两个带相同启动子的模板合并一起做体外转录,最后再退火而得到dsRNA,还可以节省试剂。另外如果PCR时在模板两头带上同样的RNA聚合酶启动子,就可以用同一个模板在体外转录过程中同时合成双链dsRNA,省却退火一步,结果只是dsRNA两端多了启动子的序列。我们也可以将片段克隆到带2个反向相同RNA聚合酶启动子之间的载体上达到同样的目的。体外转录试剂选择的要点就是产量,速度;由于要避免dsRNA部分序列和其他基因重叠,避免非目标基因的沉默或者脱靶,通常不会选择太长的片断作为dsRNA的模板,因此对试剂盒合成dsRNA的长度,倒是不一定要求太高。

1. 号称RNA公司的Ambion是最早推广RNAi试剂的厂家之一,去年初被生命科学领域的巨头ABI以2.73亿美金高价收购其RNA部门而震动业界,2006和2007年连续成为美国The Scientist杂志最受欢迎的RNAi产品品牌大奖,可见其产品声誉和影响力之大。Ambion特别为非哺乳动物细胞体系的RNAi实验推出了MEGAscript RNAi Kit(20rxns),以目标基因两端带T7聚合酶的PCR产物或者质粒为DNA模板,提供除模板外,体外转录反应涉及的各种试剂,每次反应可得到高达80ug的纯化的dsRNAs,最长可达1.2kb。体外转录得到dsRNA后,利用试剂盒提供的DNase和单链特异的RNase降解反应产物中的DNA模板和单链未配对的RNA,最后用试剂盒提供的纯化柱去除蛋白质,核苷酸等杂质后得到纯化的、立即可用于RNAi实验的dsRNA。这个试剂盒的特点是Ambion专利的MEGA体外转录技术,使得产量高于普通体外转录试剂盒,试剂盒包含了体外转录合成dsRNA和后继纯化所需试剂,包扩DNase(消化DNA模板),单链特异的RNase(用于消化未匹配为双链的单链RNA),和RNA纯化柱等成分,对以异常敏感的RNA实验来说可以省却不少麻烦。4600RMB/20次反应(每次反应成本230多,不计折扣),——用这种方便齐全又好用的试剂盒做实验,实验过程也是快乐流畅滴。至于付款时的烦恼,留给亲爱的老板吧。

2. 纽英伦(New England Biolabs)的HiScribe RNAi试剂盒也是一个合成双链RNA的试剂盒。这个盒子的特点在于提供了LITMUS克隆载体,这个载体多克隆位点的两端有反向T7启动子序列,将目标基因克隆到载体中后,即可以用试剂盒提供的T7引物PCR得到两端带T7序列的模板,也可以分别用T7启动子后的2个酶切位点分别单酶切线性化质粒,使酶失活后再混合,得到2种不同的模板,再同时进行体外转录,退火,得到除多克隆位点外不含其他冗余序列的RNA,避免T7聚合酶在合成目标基因RNA时通读载体上的序列,影响RNAi结果。除体外转录试剂外试剂盒提供载体和对照载体,T7引物,分子量Marker等,还需要自行购买DNase,单链特异RNase(核糖核酸酶I)以及dsRNA纯化工具。试剂盒2007年价格在3969元人民币,可合成总量高达2mg的dsRNAs,长度可达1.3kb。

3. Promega公司的T7 RiboMAX Express RNAi System也是一个体外合成dsRNA的试剂盒。特点是合成速度很快,30分钟完成体外转录,适合合成200-400bp或者更长的dsRNA,还可以用于合成21bp的siRNA。产品提供T7 RNA聚合酶,Buffer(含NTP),消化DNA模板用的DNase和消化单链RNA用的RNase,对照模板,最后需要用异丙醇沉淀来纯化得到的dsRNA。整个试剂盒足够合成最高可达2mg的dsRNA,由于没有配纯化的离心柱,可根据需求决定每次使用试剂的量。不带Marker和引物等对照,价格3195,真不愧是美国“大宝”,价格便宜量又足啊。

4. 如果不怕麻烦,小米加步枪也可以的。通过PCR的方法,或者克隆的方法得到两端带有T7启动子的基因片段模板,自行组装试剂组合----T7 RNA聚合酶,单链RNase,DNase,NTP等等,也不难,要注意防止RNase污染。纽英伦(New England Biolabs)T7 RNA聚合酶参考价格为5000U(50U/ul)才人民币696元。

全文链接:生物通ebiotech专刊之《RNAi 5年回顾及技术宝典》

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