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《自然》干细胞最新研究颠覆之前研究
【字体： 大 中 小 】 时间：2007年12月21日 来源：生物通
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来自英国爱丁堡大学（University of Edinburgh，生物通注）生命科学学院，干细胞研究院，剑桥大学威尔卡姆干细胞研究信托中心（Wellcome Trust Centre for Stem Cell Research）等处的研究人员发现一种长期以来被认为是维持胚胎干细胞多潜能（pluripotency，生物通注）和促进分化的必要因子：Nanog蛋白实际上也许并没有这么重要，这一干细胞调控因子的作用转变给干细胞研究领域提出了新的观点，也为进一步胚胎干细胞研究提出了新的课题。这一研究成果公布在最新的《Nature》杂志上。
有关干细胞的自我更新机理，近年来进展十分迅速，三年前大家普遍认为是因为oct3/4和LIF信号通路维持了胚胎干细胞的自我更新。2006年5月发现了一种重要调控因子，即Nanog因子，这种因子被认为一个ES细胞自我更新维持因子，可以独立地在LIF/Stat3因素撤去的情况下支持ES细胞的自我更新。
当时Chambers I等将敲除掉LIF受体基因的ES细胞放入小鼠胚胎成纤维饲养层（mouse embryonic fibroblast feeder， MEF feeder）细胞中培养，发现了很多小的未分化的细胞群。所以除了MEF feeder分泌的因子LIF经过LIF受体（LIFR）作用从而维持ES细胞多潜能性外，肯定存在其他机制维持未分化状态。于是他们从ES细胞和MEF共培养物中制备cDNA文库，将文库cDNA来转染敲除掉LIFR的LRK1细胞并在无细胞因子的培养基内培养，发现有两个池存在形状类似未分化状态的细胞。将其纯化的质粒DNA再次转染LRK1形成了表达Oct4的具有自我更新能力的ES细胞。其cDNA经测序发现是新基因，为纪念凯而特（Celtic）传说中的地名，Tir nan Og，将该基因命名为Nanog。GenBank序列号为AY278951（生物通注）。
领导这一研究的是爱丁堡大学的Ian Chambers博士，他表示，“之前的研究认为Nanog能无限引发分化（coupled to differentiation）”，“而这一新研究则表明，没有表达Nanog的胚胎干细胞依然可以进行自我更新和分化。”
虽然之前的研究表明早期胚胎在没有Nanog存在的情况下是不能存活的，但是这一蛋白的表达水平至今也还不清楚，Chambers研究小组检测了未分化小鼠胚胎干细胞细胞核中的Nanog的表达水平，结果发现实际上，在未分化的干细胞中这种因子表达的水平是上下波动的。而且研究人员还发现自我更新与Nanog表达并没有关系，因为在Nanog被敲除的细胞中，仍然可以进行自我更新——即使更新率比较低。但是研究人员也认为Nanog依然是一种对于生殖细胞（germ cells，生物通注）形成的必要因子。
Chambers表示，之前研究人员认为Nanog对于自我更新的调控是一种开-关的形式，但是这一新的观点则认为Nanog更加可能是一种dimmer开关：当Nanog表达增多的时候，自我更新就增多。因此应该有一些其它的蛋白担负起开-关的作用，对自我更新有更强的调控作用。
来自纳布拉斯加大学医学院的Angie Rizzino（未参与此次研究）认为，“这将帮助我们增加对于Nanog在胚胎发生过程中的作用的深入了解”，“但是我有所质疑的是这并没有描述完整个事件”，尤其是，为什么Nanog在早期胚胎发育过程中如此重要，但在自我更新和分化过程中作用就没有那么明显了。
近期干细胞研究取得了主要的进展：来自威斯康星州大学麦迪逊分校的James Thomson研究小组将人类体细胞进行重组变成了胚胎干细胞，在这项研究中，Nanog因子起到了提高克隆存活率的作用，但是对于重组细胞而言是非必需的。因此Chambers研究小组怀疑Nanog能通过抑制其它基因的表达稳定胚胎干细胞。进一步的确认还需要深入的研究。
（生物通：张迪）
原文摘要：
Nature 450, 1230-1234 (20 December 2007) |
doi:10.1038/nature06403; Received 21 September 2007; Accepted 22 October 2007
Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development
『Abstract』
附：Nanog简介（来自《多潜能性维持因子Nanog研究进展》）
1 Nanog的发现
Chambers I等将敲除掉LIF受体基因的ES细胞放入小鼠胚胎成纤维饲养层（mouse embryonic fibroblast feeder， MEF feeder）细胞中培养，发现了很多小的未分化的细胞群。所以除了MEF feeder分泌的因子LIF经过LIF受体（LIFR）作用从而维持ES细胞多潜能性外，肯定存在其他机制维持未分化状态。于是他们从ES细胞和MEF共培养物中制备cDNA文库，将文库cDNA来转染敲除掉LIFR的LRK1细胞并在无细胞因子的培养基内培养，发现有两个池存在形状类似未分化状态的细胞。将其纯化的质粒DNA再次转染LRK1形成了表达Oct4的具有自我更新能力的ES细胞。其cDNA经测序发现是新基因，为纪念凯而特（Celtic）传说中的地名，Tir nan Og，将该基因命名为Nanog。GenBank序列号为AY278951。 Mitsui K等利用另外一种方法也同样发现了Nanog，他们先利用数字差异显示对小鼠ES细胞和其他体细胞系的EST文库进行比较发现一些特异的在ES细胞中表达的基因，包括oct4、utf1、rex1，Northern blot分析发现了9个尚未鉴定的ES细胞特异表达基因，称其为ecat(ES cell associated transcripts)。他们利用超转染系统分别表达以上基因以鉴定它们是否具有独立于LIF而维持自我更新状态的性质。在无LIF培养系统中只有转入ecat4的ES细胞具有自我更新能力，这说明ecat4就是Nanog。Wang S H等研究发现和Nanog具有同样表达特性的基因ENK。之后很多实验室通过不同手段验证了Nanog的特异性表达。为防止混淆，统一命名为Nanog。
2 Nanog序列特征
小鼠Nanog序列全长7.1 kb，包含4个外显子，外显子和内含子间的剪接位点符合GT-AG规则，同源框序列位于第2和第3外显子[12]。Nanog cDNA序列由2 184碱基组成，含有一个开放阅读框，编码305个氨基酸组成的多肽。SMART分析显示Nanog同源域位于96号氨基酸残基和155号氨基酸残基之间，与以前发现蛋白无明显同源性。发现具有较高同源性的结构域存在Barx1、Msx1和NK2同源域蛋白家族的一些成员。 Nanog经分类后归于ANTP超家族NK-2型同源框基因[12,15-16]，其同源域外并不存在保守基元（motif），表明它是一个特殊的具有多样性的同源域蛋白。BLAST分析显示小鼠Nanog和大鼠Nanog具有87％的同源性，和人NANOG存在58％的同源性。在同源域序列具有较强的保守性，和大鼠，人各具有94％和87%的同源性。另外，在小鼠Nanog198残基～243残基区域内每5个残基出现一个色氨酸残基。尽管有少量的插入和缺失，色氨基酸残基的间隔在人和大鼠中是保守的。比较分析显示人类FLJ12581与Nanog最为类似。小鼠Nanog定位于6F2区域[12]，人NANOG位于12p13，和STELLA、GDF3相邻。最近研究发现这两个基因在人多潜能性细胞中具有特异性表达。Yang Y等通过人类基因组和猪的基因组比较发现猪Nanog所在染色体5q21～24与人12号染色体具有同源性[18]。另外在人类基因组中还发现了10个假基因和一个重复性假基因[15]。最近的研究表明ES细胞特异性表达的基因(如Nanog、STELLA和Oct4)具有的假基因数量远超过其他组织特异性基因，可能是由于逆转录转座（retrotransposition）造成的，假基因的数量也许可以成为ES细胞特异性基因的标记。
3 Nanog的表达及调控
在成纤维细胞，造血细胞等分化了的细胞中未发现有Nanog的 mRNA，但是在具有多潜能性的组织和细胞系中却大量表达，包括ES细胞、EG（embryonic germ cell）细胞，依靠和不依靠LIF的EC(embryonic carcinoma)细胞系。在ES细胞分化时，Nanog mRNA明显减少。并且在ES细胞集聚(aggregation)时，外面的一层细胞不论有无LIF存在都分化为原始内胚层样细胞，这个过程中Nanog的表达受到ES细胞集聚的抑制，和LIF/Stat3、BMP4通路无关，现在还不知道ES细胞的集聚产生了何种因子从而抑制了下游的Nanog表达[20]。Nanog在早期胚胎发育的表达表现为[21-22]：在早期卵裂阶段没有明显表达，首先能检测到其mRNA的时期是桑葚胚阶段，到了早期囊胚，Nanog的表达只限于ICM，在滋养外胚层没有表达，晚期囊胚时其mRNA进一步只出现在上胚体而在原始内胚层中不存在。一旦胚胎附植开始后，Nanog的 mRNA只出现在上胚体区域，其中近前端表达水平最高，进入原条期表达开始迅速减少。妊娠期9 d~13 d，在迁移中PGC和到达生殖嵴的PGC也同样检测到Nanog mRNA的存在，于E1 1.5 d小鼠胚胎的生殖嵴中就明显发现了其mRNA。体细胞来源的Nanog通过核移植形成重构囊胚或者与ES细胞融合形成细胞也能表达Nanog，这与核重编程紧密相关。另外，具有杂合子Nanog（＋/—）的ES细胞相对纯合体ES细胞易造成ES细胞走向分化，这说明ES细胞是否分化依赖于Nanog表达量的高低。
以前的观点认为，LIF/gp130是维持细胞多潜能性的惟一通路，Chambers等和Mitsui等的研究证明Nanog是独立于该通路的另外一个途径。主要有以下证据：①Nanog能够支持LIFR敲除的ES细胞或加入LIFR颉颃剂的ES细胞的自我更新说明Nanog的作用绕过LIFR/gp130。②Nanog在Jak颉颃剂存在的情况下依然支持ES细胞自我更新说明其作用可以绕过LIFR/gp130的下游Stats3。在Nanog转染的细胞中，Stat3表达没有变化并且可以敲除但不影响ES细胞的自我更新说明Nanog通路独立于STAT3。但是内源性Nanog并不足以支持ES细胞的未分化状态，由于STAT3和Nanog通路的相互独立，说明在正常的ES细胞内，两者协同作用来达到此目的。Chambers等证明当Nanog过量表达和LIF同时存在时，ES细胞能得到最大的更新程度。Mitsui等认为Nanog可能直接抑制GATA6的表达从而抑制ES细胞的分化，GATA6和GATA4产物都促进细胞分化。GATA6可能是GATA4的上游。Pan G等研究认为Nanog通过其C端不常见的强结构域来激活基因的转录[16]。这两个结构域为WR（W repeat）和CD2(C-terminal domain)，前者是10个连续的以色氨酸残基开头的五肽重复，色氨酸突变显著降低Nanog的转录活性。近来发现Nanog在视黄酸诱导人NT2细胞分化为神经元时表达下降伴随其5′端甲基化程度成梯度增加[23]。另外有研究认为Nanog的转录与其5′端高度保守的Octamer和Sox元件有关，可能是Oct4和Sox2的相互结合或其他ES细胞特异表达的Sox结合因子调控其转录[24]。Nanog和Oct4的剂量效应和干扰表达的结果都有所不同，Nanog过量表达支持无LIF情况下ES细胞的自我更新，而Oct4却导致ES细胞分化为各种细胞。Nanog干扰表达的ES细胞分化为体壁和内脏内胚层细胞，而敲除Oct4的ES细胞分化为滋养外胚层。因此有人认为在早期发育过程中，第1次细胞命运决定出现在桑葚胚，或发育为滋养层，或保留一部分全能细胞，这个时期，Nanog表达量少，Oct4起决定作用。第2次命运决定出现在囊胚期，ICM部分保持多潜能性，部分分化为原始内胚层，Nanog在这个时期起决定作用。
