两步法全自动纯化GST融合蛋白[创新技巧]

用AKTAxpress 色谱系统GSTrap 4B 柱和Hiload 16/60 Superdex
200 pg 柱进行两步法全自动纯化GST-hippocalcin

J. Lundqvist and A. Karlsson
GE Healthcare, Uppsala, Sweden

用AKTAxpressTM智能蛋白质多维纯化系统进行两步、全自动纯化，从E . C o l i 裂解液中纯化G S T - 标记的hippocalcin (海马钙结合蛋白)。两步法的第一步是亲和层析捕获，该步主要使用1 ml GSTrap TM 4B柱，第二步是凝胶过滤，该步主要使用HiLoadTM 16/60 SuperdexTM200 pg 柱。使用两步纯化法可以获得高纯度的SThippocalcin，并显示出GST-hippocalcin目标蛋白质的二聚体和一个大的多聚体。

导言

谷胱甘肽S- 转移酶 (GST) 是继组氨酸之后的第二个应用最多的重组蛋白标记。GST 基因融合系统利用质粒pGEX在E.coli中进行可诱导、高水平细胞内表达基因或与日本血吸虫 (Schistoma japonicum) GST 融合的基因片段 (1)。通过用谷胱苷肽琼脂糖的层析柱捕获，然后用还原型谷胱苷肽洗脱可以很方便地纯化出标记蛋白质。GSTrap 4B柱是一些新型1-ml和5-ml HiTrapTM柱，便于纯化GST- 标记蛋白和谷胱甘肽结合蛋白。这类柱子用谷胱甘肽琼脂糖4B预包被，以增加其对GST-标记蛋白的结合力。用GSTrap 4B 柱纯化GST- 标记蛋白仅用注射器、泵、或AKTAdesignTM 和FPLCTM 系统等色谱系统即可进行。此外，这类柱子的设计旨在易于扩展纯化以及用一步和两步法纯化GST- 标记蛋白。

本文介绍两步法全自动纯化谷胱甘肽S-转移酶 (GST) 标记的海马钙结合蛋白 (hippocalcin)。第一步是亲和层析捕获，采用一个1-ml GSTrap 4B柱；第二步是凝胶过滤精纯 (gel filtration polishing step)，采用HiLoad 16/60Superdex 200 pg 柱。应用AKTAxpress 系统进行纯化，该系统是一种专门用于全自动、多维纯化蛋白质的智能型色谱系统。

方法

先用酶裂解含有GST-hippocalcin的E coli BL21细胞，然后再用超声裂解。裂解液在20 °C 离心，然后通过0.45mm的过滤器过滤。待样品澄清后把5 ml澄清的裂解液上样到一个1-ml GSTrap 4B柱上，进行第一步亲和层析捕获。用LoadTM 16/60 SuperdexTM 200 pg 柱进行第二步凝胶过滤精纯 ( pol ishing) 。两步法的模板用UNICORNTM 软件创建。

AKTAxpres s 系统能够全自动地把来自第一步捕获(GSTrap 4B 柱) 的洗脱混合的目标蛋白组分加载到HiLoad 16/60 Superdex 200 pg 凝胶过滤柱上。用于1-ml GSTrap 4B 柱上亲和色谱捕获 (AC) 的样品、结合及洗脱缓冲液和用于凝胶过滤一步法的缓冲液的细节如图1 所示。

所有的缓冲液在使用之前都要脱气。用ExcelGelTM SDS Gradient 8-18 凝胶在MultiphorTM II 电泳系统上，通过SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)检测目标蛋白质的纯度。

结果

图1显示了全自动两步法纯化的色谱图和目标蛋白洗脱池的SDS-PAGE。凝胶过滤后得到了两个峰，一个峰较高，一个峰较低，SDS-PAGE显示出这两个峰都包括GSThippocalcin(高峰：图2，4 道;低峰:数据未显示)。根据对凝胶过滤 (GF) 一步法的评估，高峰似乎是GSThippocalcin二聚体。低峰是GST-hippocalcin多聚体，如图2，4 道所示，所得GST-hippocalcin 纯度较高。

结论

采用两步纯化法可以提高GST-hippocalcin 的纯度。本文所述全自动AC-GF两步纯化法可获得高纯度的蛋白，同时能提供GST标记目标蛋白的多聚体信息，而单独使用一步法不可能做到这一点。

色谱柱: GSTrap 4B, 1 ml
HiLoad 16/60 Superdex 200 pg, 120 ml
样品: Clarified E. coli lysate containing expressed GST-hippocalcin, Mr 45 000
样品体积: 5 ml (GSTrap 4B)
结合缓冲液 (GSTrap 4B): 10 mM sodium phosphate, 140 mM NaCl, 20 mM DTT, pH 7.4
洗脱缓冲液 (GSTrap 4B): 50 mM Tris-HCl, 20 mM glutathione, 20 mM DTT, pH 8.0
缓冲液 (HiLoad Superdex): 10 mM sodium phosphate, 140 mM NaCl, 20 mM DTT, pH 7.4
Flow rate: 上样, 0.3 ml/min (GSTrap 4B)
洗脱, 1 ml/min (GSTrap 4B),
1.5 ml/min (HiLoad 16/60 Superdex 200 pg)
运行温度: 22 °C
色谱系统: AKTAxpress

图1. (A) 用AKTAxpress 通过全自动两步纯化法从E. coli 裂解液中纯化GST-hippocalcin。
(B) 放大凝胶过滤得到的峰显示纯化的GST-hippocalcin 两个峰为多聚体和二聚体。

泳道
1. LMW markers
2. 起始物质，稀释1:10
3. GSTrap 4B 亲和层析流出液，稀释1:10
4. 来自凝胶过滤、未经稀释的GST-hippocalcin 洗脱峰
图2. SDS-PAGE (ExcelGelTM SDS Gradient 8-18) 显示GST-hippocalcin
的最终纯度 (第4 泳道)。

参考文献
1. GST Gene Fusion System Handbook, Amersham Biosciences, 18-1157-58 (2002).

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www.gehealthcare.com/hitrap