动植物miRNA的生物合成、作用机理及其功能 [创新技巧]

动植物miRNA的生物合成、作用机理及其功能

作者:龙茹 李玉花 徐启江 

microRNAs  (miRNAs)是生物体内源长度约为20－23个核苷酸的非编码小RNA，通过与靶mRNA的互补配对而在转录后水平上对基因的表达进行负调控，导致mRNA的降解或翻译抑制。到目前为止，已报道有几千种miRNA存在于动物、植物、真菌等多细胞真核生物中，进化上高度保守。在植物和动物中，miRNA虽然都是通过与其靶基因的相互作用来调节基因表达，进而调控生物体的生长发育，但miRNA执行这种调控作用的机理却不尽相同。同时miRNA在动植物体内的形成过程也存在很多的不同之处。本文综述了动植物miRNA的生物合成、作用机理、生物功能等方面的研究进展。 
 

微小RNA (microRNA，简称miRNA)是与转录后基因沉默相关的一类长度为21 － 25nt 的重要RNA，1993年，首次在秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)中发现[1]。现已证实，miRNA 广泛存在于真核生物细胞内，是最大的基因家族之一，大约占到整个基因组的1%[2]，在精细调控基因表达及生物生长发育过程方面发挥着重要作用[2-3]。任何miRNAs的失调都会导致细胞调控事件的剧变[4]。最近研究表明，miRNA在生物体内的多样化调控途径中扮演着关键性角色，包括控制发育进程、细胞分化、细胞凋亡、细胞分裂以及器官的发育。miRNA与其靶分子组成了一个复杂的调控网络，如某一特定的miRNA 可以与多个mRNA 分子结合而发挥调控功能，反之，不同的miRNA 分子也可以结合在同一mRNA 分子上，协同调控此mRNA 分子的表达[5]。

本文综述了动物和植物中的miRNA在生物发生、作用机理及功能等方面研究进展。

1　miRNA的生物合成

研究发现，动植物细胞内的miRNA 都是一组非编码蛋白质的短序列RNA[6]，具有很高的保守性[7]。miRNA是由RNA聚合酶Ⅱ在基因组的不同区域转录形成较长的pre-miRNA，然后加工而成[8]。动物miRNA广泛存在基因簇现象，即多个miRNA由同一个前体RNA加工而来，且来自同一基因簇的miRNA具有较强的同源性，不同基因簇的miRNA的同源性则较弱[9]，基因组的基因之间及结构基因的内含子区域均存在大量编码miRNA 的基因，因此，来源于 pre-mRNA 内含子区域的miRNA 伴随pre-mRNA的剪接而形成；而植物miRNA多数由单一pre-RNA加工而来，只有极少数miRNA，如miR395 存在基因簇现象[10]。除了极少数特例(编码miR402 的基因被发现存在于 pre-mRNA 内含子区域[11])，编码miRNA的基因主要存在于编码蛋白的基因之间的区域，且大多是远离 miRNA目标基因的独立的转录单元。

动物中，细胞核内编码miRNA 的基因首先在RNA聚合酶Ⅱ的作用下发生转录，形成长度约为几百个核苷酸的初级转录物— pri-miRNA[12]，初级转录物在 RNase III 家族酶—— Drosha 的作用下进一步被加工成为只含60 － 70 nt 具有茎环结构的单个miRNA 前体—— pre-miRNA[13]，由转运蛋白Exportin-5 运送到细胞质；在另一个RNase III 家族
酶—— Dicer 的参与下，miRNA 前体被加工形成双链miRNA，随后miRNA 的双链解链形成成熟的miRNA[14]。成熟的miRNA 通过与一种类似RISC（the RNA-induced silencing complex）的核糖核蛋白结合形成miRNP 而发挥作用[15]。

植物中，细胞核内编码miRNA 的基因的转录与加工是偶联的，即miRNA的形成过程是在细胞核中完成的，不存在miRNA前体从细胞核到细胞质的运输过程。首先，细胞核中编码miRNA 的基因在RNA聚合酶Ⅱ的作用下转录形成长度约为几百个核苷酸的初级转录物—— pri-miRNA；然后在一种类Dicer 酶—— DCL1 的作用下形成miRNA 前体premiRNA[16]，该前体长度一般为64 － 303 nt， DCL1继续作用于pre-miRNA 而形成双链miRNA；最后，双链miRNA在miRNA甲基转移酶——HENI的作用下，使3' 端最后一个核苷酸发生甲基化修饰。甲基化的主要作用是阻止转移酶、聚合酶的活性[16]。

以上过程均在细胞核中完成的。成熟的miRNA或者是在细胞核中与类似RISC 的核糖核蛋白结合形成miRNP，然后被Exportin 5 的同源物——HASTY运送到细胞质中，或者是先被HASTY 运送到细胞质中，再与核糖核蛋白结合形成miRNP。
2　miRNA的作用机理

miRNA 可以指导RISC 在转录后水平上下调基因的表达：mRNA 的降解或翻译抑制。采取何种沉默方式是由mRNA的特性所决定的，如果mRNA能够与miRNA完全互补，该mRNA就会被RISC特异地降解；如果mRNA 不能与miRNA 完全互补，仅在某个位点与miRNA 互补，那么RISC 就不会特异地降解mRNA，只是阻止mRNA作为翻译的模板而不能合成蛋白质[17-19]。研究发现， 在植物和动物发育过程中，miRNA与靶mRNA结合的程度和部位不同，作用方式也不同。在动物中，多数miRNA 以不完全互补方式与其靶mRNA 的3' 端非翻译区的识别位点结合，从而阻碍翻译机器对该mRNA的翻译来调控基因表达，但不影响mRNA的稳定性。如线虫中的miRNAlin-4就是以这种方式调控它的两个靶基因——lin-14和lin-28 的翻译[20-21]。

植物中，miRNA 与靶mRNA 的结合位点在开放阅读框中，而不在3' 端非编码区，并且这种结合完全互补，致使靶mRNA 降解，从而引发了基因沉默。此现象是Hutvagner 和Zamore[15]对拟南芥miRNA let-7 的研究时首次发现的。后来Leave 等[22]也证明，拟南芥中miR171 可与SCL 转录因子家族3 个成员的内部序列完全互补，并以类似RNAi的作
用途径降解靶mRNA。

3　miRNA在几种动植物模式生物中的功能

至今仅在多细胞的生物体中发现了miRNA，这暗示miRNA 的功能很可能与细胞及组织的分化有关，最近的许多研究证实了这一点。Kanellpoulou等[23]研究发现：不能形成miRNA的小鼠胚胎干细胞能够生存但不分化；而斑马鱼的生殖细胞不需要miRNA也能进行正常的生命活动并可分裂产生新的生殖细胞[24]。因而，未分化的或分化程度很低的细胞不需要miRNA 维持其功能，但miRNA 在多细胞生物的生长发育中起着非常重要的作用。

3.1　miRNA 在拟南芥(Arabidopsis thaliaha)中的功能　

已在拟南芥中发现了几十种miRNA，其中多数miRNA 的靶基因是转录因子或与个体发育和信号转导有关的调控蛋白的编码基因，它们可能参与植物激素信号通路、叶片的生长、植物器官的识别和再生、器官边界的形成与分离、器官的极化、发育阶段的转换和小RNA代谢等过程[16]，但对其靶基因和功能了解得非常清楚的miRNA 并不多。

Palatnik 等[25]研究表明，miR-Jaw是控制植物叶和其他细胞分裂的miRNA，在叶片形态发生中具有重要的作用。只有Jaw与靶序列—— TCP 正确作用才能发育形成扁平叶。miR-Jaw 的过量表达可使细胞分裂过旺，导致叶片表面凸起卷缩，并可延迟开花时间。Millar 和Gubler[26]发现，miR159 在拟南芥中通过调控MYB33和MYB65两种转录因子基因调节
植物的生殖发育。MYB33 和MYB65 在花粉囊的发育过程中能阻止绒毡层的过度生长。过量表达miR159将导致开花时间延迟和花粉囊发育缺陷使繁殖能力丧失。另外，有研究表明，miR164 通过对靶基因CUP SHAPED COTYLEDON (CUC)1, 2等的作用，调控分裂组织中的边界尺寸以及胚胎、营养器官和花的形成与分离。miR164过量表达将导致花器官的融合，有时会导致子叶融合。CUC2 的表达能够恢复萼片分裂，使萼片间边界宽度增加，CUC1的表达会减少萼片数量，同时增加花瓣的数量，并使叶子变宽[27-28]。

拟南芥中还有一类调控分裂组织功能和维管系统、侧生器官极性的miRNA ——miR165/166，它有三个靶基因——PHABULOSA (PHB)、PHAVOLUTA(PHV)和REVOLUTA (REV)，这三个靶基因是HDzip基因家族的成员，HD-zip 和KANADI(KAN1, 2, 3)两类家族基因间的反相互作用调控植物体的侧生器官——叶、花以及维管系统的极性(即近轴面和远轴
面的不同)。HD-zip 基因在分生组织和侧生器官的近轴区表达，而KAN 基因则在侧生器官的远轴区表达。miR165/166缺失将会使叶片远轴区域基因发生持续突变，因此，导致近轴化叶片和花器官的形成[16]。

3.2　miRNA在秀丽隐杆线虫(C. elegans)中的功能　

lin-4[1]是最早发现的miRNA，它参与线虫发育的时序调控。lin-4 有两个靶基因—— lin-14 和lin-28。lin-14 编码一种核蛋白，可调控线虫从幼虫L1 期到L2 期的转换；lin-28 编码一种冷休克锌指蛋白，可促使线虫从幼虫L2 期向L3 期转换[20]。lin-4 功能缺失会导致线虫在幼虫晚期重复出现幼虫L1 期的特征，结果使线虫的成熟结构缺失(如成熟表皮、阴门)和排卵受到阻碍[1]。let-7[29]是线虫中又一发现较早的miRNA，它与lin-4 一样，参与线虫发育的时序调
控。let-7 有lin-41、hbl-1、daf-12、pha-4 和ras 五个靶基因，其中lin-41 编码一种RBCC(ring finger，B box，
coiled coil)蛋白。lin-41 如果被抑制则导致幼虫多蜕一次皮，使幼虫期产生成熟表皮；lin-41 的过量表达导致幼虫少蜕一次皮，使成虫带有幼虫的表皮[30];hbl-1[31]则与成体腹神经索神经元的发育时序有关，负调控成体时序特异性转录因子LIN-29；hbl-1 的3'UTR 同样也具有let-7 的靶位点。

lsy-6 和 miR-273 两种miRNA的级联通路介导线虫中化学感觉受体基因(GCY-7 / GCY-5)的左/右非对称表达。这种非对称性表达是线虫感觉识别系统的一部分，使其能区分周围环境中各种吸引性或排斥性的化学刺激。线虫包括ASE left(ASEL)和ASE right(ASER)两种非对称化学感觉神经元；ASEL 和ASER能检测到不同的化学物质，两者的协同作用能使线
虫对外界化学刺激作出选择性应答。lsy-6 在ASEL中表达，并抑制其靶基因cog-1，最终促使GCY-7 高表达且抑制GCY-5 的表达[27]; miR-273 在ASER中表达，并抑制靶基因DIE-1(lsy-6 的上游调控因子)，最终促使GCY-5 高表达且抑制CY-7 的表达[32]。

3.3　miRNA在果蝇(Drosophila melanogaster)中的功能　

在果蝇中已知的miRNA并不多，包括Bantam、miR-14、miR-7 等，其中Bantam是研究最清楚的一个miRNA。Bantam的靶基因是Hid，Hid 编码的蛋白能抑制细胞分裂增殖，从而导致细胞程序性死亡[33]。

如果Bantam在组织中过量表达，就会促进细胞分裂增殖而抑制细胞程序性死亡；相反，Bantam 功能的缺失会导致果蝇的死亡。因此，Bantam 对细胞程序性死亡基因是一种负调控。miR-14 也起到调节细胞凋亡的作用。Xu 等[34]研究认为miR-14 的靶基因可能是Drice，Drice 编码的蛋白能够调控细胞程序性死亡和脂肪代谢，因而miR-14是细胞程序性死
亡的强抑制剂。miR-14 功能的缺失会使细胞大量死亡，而miR-14 的过量表达会抑制细胞死亡。miR-7是与Notch 信号通路有关的一种miRNA。miR-7 的异位过量表达会导致下游Notch靶基因——Cut表达
量的减少，使果蝇出现翅缘缺刻等现象[35-36]。

3.4　miRNA 在斑马鱼(zebrafish)中的功能　

Wineholds等[24]研究斑马鱼胚胎发育时发现，早期未分化的胚胎细胞中多数miRNA 是不表达的。dicer 缺陷型斑马鱼的胚胎早期发育正常，但是在受精8d 后，由于母源性Dicer 酶耗尽，miRNAs 无法成熟而死亡。将母本的Dicer mRNA 敲除，发现在开始的24h 内，这些胚胎依然发育正常，但在随后的早期胚胎发育中死亡。以上现象表明，miRNA 在早期胚胎发育中并不重要，但对于后期胚胎的生长和发育是非常重要的。在斑马鱼胚胎发育早期唯一高效表达的miRNA是miR-430家族的成员。Giraldez等[37]在dicer突变型斑马鱼的胚胎中注射miR-430 可有效的改变大脑形态的畸形，也可在某种程度上调节神经发育。另外，在干细胞中，dicer-1 突变型的细胞停滞在G1 期而不发生分化，这说明某些miRNA 调控干细胞从G1 期到S 期的转换[23]。

3.5　miRNA 在小鼠(mouse)中的功能　

miRNA在哺乳动物胚胎发育中起着相当重要的作用。在胚胎发育中，有些miRNA的作用是相当明显和具体的，如
miR-196、miR-1、miR-143 等；有些miRNA 的作用则不是具体的，但却在很多生理过程中都起作用，如miR-375、miR-122a 等。现就其功能做一介绍。miR-196 的靶基因是HOXB8，在发育15 d的小鼠胚胎中，可直接降解HOXB8 基因编码的
mRNA，同时可能抑制HOXC8、HOXD8 和HOXA7的表达[38]。miR-1 的靶基因—— Hand2 编码转录因子，能促进心室心肌细胞扩张[39]。miR-1 在小鼠心脏发育中能调控心肌细胞在分化和增殖间的平衡。在转基因的小鼠心脏中miR-1 的过量表达，将使心肌细胞失去增殖和扩张能力，暗示了心肌细胞分化的不成熟[41]。miR-143 在脂肪组织中表达相当高，调控脂肪细胞的分化；敲除miR-143 将抑制脂肪细胞特异性基因的表达，导致甘油三酯的累积并增加潜在靶基因Erk5 的表达水平[40]。miR-375 在鼠胰岛细胞中特异表达，调控Mtpn 基因以及葡萄糖调控的胰岛素胞外分泌[41]; 另外，miR-375 还在斑马鱼脑下垂体高效表达。这表明miR-375 还可能通过调控Mtpn 基因的表达水平，调节其他激素和神经内分泌产物的分泌[37]。miR-122a 在成体肝脏中高表达，且在哺乳动物肝脏发育过程中是上调的，靶基因CAT-1 与miR-122a 的表达负相关，因此，在成体肝脏中检测不到CAT-1[42]; 同时还发现miR-122a在小鼠睾丸精子发生过程中差异表达，靶基因Tnp2(Transition protein 2)为转录后调控的睾丸特异性基因，参与精子发生过程中的染色质重建[43]。

4　miRNA与人类(human)疾病

近年来的研究发现，miRNA与人类多种疾病的发生、发展有关。Caldas 和Brenton[44]研究表明，在许多癌细胞中，miRNA 的表达水平都会发生改变，推测它们可能起到原癌基因和抑癌基因的作用。如mir-17-92 簇上游调控因子为原癌基因——c-Myc，它编码一种调控细胞增殖、生长、凋亡的转录因子。该簇在B 细胞淋巴瘤中上调；其过量表达会阻断凋亡途径并加剧c-Myc 诱导的B 细胞淋巴瘤的形成[45]。因而miR-17-92 簇具有癌基因特性。在人类肺癌患者中let-7 miRNA 表达水平降低；同时体外实验表明，在肺腺癌细胞系A549 中let-7 的高表达则抑制了肺癌细胞生长[46]。现已证实miRNA 与人类病毒感染性疾病也有关。如Sullivam等[47]研究表明，SV40 编码的2 种miRNA可以与早期病毒mRNA完全匹配并使匹配的mRNA 降解，这能减少病毒T 抗原的表达但不减弱病毒的感染能力，从而减少T 细胞对病毒的敏感性
并使细胞因子产生得更少：因此该2 种miRNA在总体上有利于病毒的成功感染。Lecellier 等[48]研究表明内源性miRNA 也可介导抗病毒防御，如miR-32是由宿主产生的内源性miRNA，可阻断逆转录酶病毒PFV-1（primary foamy type 1）在人体细胞内的积累；PFV-1 编码的一种蛋白Tas 可部分抑制miRNA 诱导的对PFV-1 累积效应的阻断。

5　展望

miRNA的发现是RNA研究领域的一个里程碑式突破。miRNA 是生物体内一类重要的小RNA，具有调控生物体的生长发育、细胞程序性死亡以及新陈代谢等多种功能。目前，虽然已经鉴定出了大量的miRNA，但作用机理以及许多miRNA 的生理功能还不是很清楚。随着对模式生物体内miRNA的形成、功能及作用机理的深入研究，最终将能解释为什么miRNA在动物和植物中功能相似而作用机理不同，以及miRNA在不同生物体中是如何调控其生长发育的，使人类更好地了解生命的本质，同时应用于重大疾病的治疗。