四川大学最新文章发表siRNA新方法

　　

生物通报道：来自四川大学华西医学中心微生物学教研室，成都生物制品研究所（Institute of Chengdu Biological Products）的研究人员通过构建质粒pAd-hTR证明了hTR siRNA在HeLa细胞系中有效和特异的端粒酶的敲除，从而指出了这种siRNA表达重组腺病毒系统在癌症基因治疗方面的前景。这一研究成果公布在《Cancer Gene Therapy》杂志上。

领导这一研究的是四川大学华西医学中心微生物学教研室主任李明远教授，其早年毕业于华西医科大学医学专业，之后在美国著名的St. Jude Children’s Research Hospital学习，学习了基因敲除、转基因和基因沉默等现代分子生物技术。目前担任四川大学华西医学中心微生物学教研室主任，中华医学会微生物学与免疫学会第六届委员会常委，《中国病原生物学杂志》、《四川大学学报（医学版）》、《国际检验医学杂志》和《西部医学》等杂志编委，《中国普外基础与临床杂志》审稿人，国家自然科学基金同行评审专家。

原文摘要：
Cancer Gene Therapy (2007) 14, 748–755; doi:10.1038/sj.cgt.7701056; published online 20 April 2007
Inhibition of telomerase RNA (hTR) in cervical cancer by adenovirus-delivered siRNA
[Abstract]

RNA沉默是存在于生物中的一种古老现象, 是生物抵抗异常DNA(病毒、转座因子和某些高重复的基因组序列)的保护机制, 同时在生物发育过程中扮演着基因表达调控的角色，它可以通过降解RNA、抑制翻译或修饰染色体等方式发挥作用。

RNA沉默存在两种既有联系又有区别的途径: siRNA(small interference RNA)途径和miRNA(microRNA)途径。siRNA途径是由dsRNA(double-stranded RNA)引发的, dsRNA被一种RNaseⅢ家族的内切核酸酶(RNA- induced silencing complex, Dicer)切割成21~26 nt长的siRNA, 通过siRNA指导形成RISC蛋白复合物(RNA-induced silencing complex)降解与siRNA序列互补的mRNA而引发RNA沉默。而miRNA途径中miRNA是含量丰富的不编码小RNA(21~24个核苷酸), 由Dicer酶切割内源性表达的短发夹结构RNA(hairpin RNA, hpRNA)形成。miRNA同样可以与蛋白因子形成RISC蛋白复合物, 可以结合并切割特异的mRNA而引发RNA沉默。尽管引发沉默的来源不同, 但siRNA 和miRNA 都参与构成结构相似的RISC, 在作用方式上二者有很大的相似性。

由于RNAi可以作为一种简单有效的代替基因敲除的工具，在功能基因组学研究、基因治疗等领域得到了越来越多的重视。为此被Science评为2001年最重要成果之一。RNAi，即引入双链RNA，通过特异性结合互补链从而抑制基因表达/引发转录后沉默。许多的研究人员开始用RNAi作为一种工具研究基因功能。较早的哺乳动物RNAi实验中，siRNAs通过化学方法合成。进一步的，开始有了商业化的体外转录方法合成siRNA的试剂盒提供，比化学合成方法经济。现在已有研究小组开发表达载体，能够在哺乳动物细胞中持续表达siRNAs。

在RNAi实验中，化学合成与体外转录方法都是在体外得到siRNA后再导入细胞内，但是这两种方法主要有两方面无法克服的缺点：siRNA进入细胞后容易被降解；进入细胞siRNA在细胞内的RNAi效应持续时间短。针对这种情况，出现了质粒、病毒类载体介导的siRNA体内表达。该方法的基本思路是：将siRNA对应的DNA双链模板序列克隆入载体的RNA聚合酶III的启动子后，这样就能在体内表达所需的siRNA分子。这种方法总体的优点在于不需要直接操作RNA，能达到较长时间的基因沉默效果。

通过质粒表达siRNAs大都是用Pol III启动子启动编码shRNA(small hairpin RNA)的序列。选用Pol III启动子的原因在于这个启动子总是在离启动子一个固定距离的位置开始转录合成RNA，遇到4—5个连续的U即终止，非常精确。当这种带有Pol III 启动子和shRNA模板序列的质粒转染哺乳动物细胞时，这种能表达siRNA的质粒确实能够下调特定基因的表达，可抑制外源基因和内源基因。采用质粒的优点在于，通过siRNA表达质粒的选择标记，siRNA载体能够更长时间地抑制目的基因表达。当然还有一点，那就是由于质粒可以复制扩增，相比起其它合成方法来说，这就能够显著降低制备siRNA的成本。

此外，带有抗生素标记的siRNA表达载体可用于长期抑制研究，通过抗性辅助筛选，该质粒可以在细胞中持续抑制靶基因的表达数星期甚至更久（比如Clontech（现属于Takara）的RNAi-Ready表达载体）。另外带有荧光标记的siRNA表达载体也受到研究者的重视与欢迎，因为带荧光标记的表达载体，可以让研究人员通过荧光标记很容易观察到载体的转染效率及目的基因的沉默效率。可通过荧光显微镜观察含有shRNA的细胞或通过流式细胞仪富集被转染的细胞。同时荧光蛋白的表达与shRNA的表达是独立的，因此不影响shRNA基因沉默的效果。

在这篇文章中，研究人员将编码人类端粒酶RNA（human telomerase RNA，hTR），长67bp的寡核苷酸引入pSIREN——一种重组腺病毒构建中的穿梭载体。然后将U6-RNA启动子和siRNA编码insert从pSIREN上剪切下来，亚克隆进pAdeno-X，构建出了质粒pAd-hTR。

接着研究人员将pAd-hTR转染进哺乳动物细胞系HEK-293，获得了携带有hTR靶向的siRNA（Ad-hTR-siRNA）的腺病毒。通过一系列的实验，研究人员证明了Ad-hTR-siRNA介导的端粒酶沉默在HeLa细胞中的作用。同时将Ad-hTR-siRNA与Ad-NT-siRNA进行比对，发现前者能极大的降低HeLa细胞中hTRmRNA水平（by 70.21%），和端粒酶活性（by 58.87%）。而且会引起HeLa细胞凋亡。

利用Ad-hTR-siRNA进行皮下肿瘤异种移植治疗可以减缓肿瘤的生长，其中至少部分是由于体内细胞凋亡（P<0.05）。总而言之，这些研究结果证明了hTR siRNA在HeLa细胞系中有效和特异的端粒酶的敲除，从而指出了这种siRNA表达重组腺病毒系统在癌症基因治疗方面的前景。
（生物通：张迪）

附1：
李明远 

教授，博士研究生导师， 1954年7月出生，汉族，中共党员。 

1982年11月毕业于华西医科大学医学专业77级，获医学学士学位；
1989年10月毕业于华西医科大学微生物学与免疫学专业，获医学硕士学位；
2001-2002年，在美国著名的St. Jude Children’s Research Hospital学习，学习了基因敲除、转基因和基因沉默等现代分子生物技术。 
1982年12月至今，一直在原华西医科大学微生物学教研室工作，历任助教、讲师、副教授和教授。现任四川大学华西医学中心微生物学教研室主任，中华医学会微生物学与免疫学会第六届委员会常委，《中国病原生物学杂志》、《四川大学学报（医学版）》、《国际检验医学杂志》和《西部医学》等杂志编委，《中国普外基础与临床杂志》审稿人，国家自然科学基金同行评审专家。

先后被评为四川省学术与技术带头人，四川省卫生厅学术带头人，四川省病原生物实验室生物安全及医用特殊物品出入境审批专家。自参加工作以来，一直坚持工作在教学和科研的第一线。在教学方面，做到既教书又育人，深受本科学生的欢迎。作为研究生导师，已培养毕业硕士研究生9名，博士研究生3名，目前有在读博士和硕士10余名。在教材建设方面，主编和参编了卫生部规划教材多本，现又被遴选为十一五规划教材主编。在科研方面，负责承担国家自然科学基金棉上项目3项，卫生部课题1项，教育部课题2项，四川省科技厅项目2项；并参加国家863课题1项。负责和主研的两个科学研究项目先后获四川省科技进步三等奖，已在国内外发表论文50余篇。 

主要学术论著：

Construction of Eukaryotic Expressing Plasmids Encoding HA and HA1 of Influenza A Virus and Their Transient Expression in HEK293 Cells 

Apoptosis in Raji cell line induced by influenza A virus

质粒介导的RNAi抑制端粒酶活性 

用髓鞘碱性蛋白建立豚鼠变态反应性脑脊髓炎模型 

抑制端粒酶活性的pSUPER RNAi系统的构建 

维生素C对病毒灭活中血浆蛋白活性的保护效应 

青蒿油诱导肝癌细胞凋亡的实验研究 

流感病毒诱导肿瘤细胞凋亡及其机制的研究 

流感病毒血凝素基因HA1区的克隆及其真核表达载体的构建 

孔雀绿比色法测定5’-核苷酸酶的活性 

甲型流感病毒血凝素基因HA和HA1真核载体的构建及其表达研究 

甲型流感病毒M2基因真核表达载体的构建及序列分析 

甲型流感病毒M2基因真核表达载体的构建及初步表达 

端粒酶相关的抗肿瘤疗法  

端粒及端粒酶对细胞衰老的影响 

SARS相关冠状病毒M蛋白基因重组核酸疫苗的实验研究  

IL-18-PE38重组免疫毒素的原核表达及其鉴定 

IL-18-PE38融合基因真核表达载体的构建及其在软骨细胞中的表达 

HPV-16 E4原核表达系统的建立和表达特性研究 

HPV16 E7蛋白编码基因原核表达与鉴定 

　

附2：siRNAs在基因治疗中的应用 
作者:胡迎宾, 李定国 来源:世界华人消化杂志

引言 

小干扰RNAs(small interfering RNAs，siRNAs)是RNA干扰(RNA interference，RNAi)过程中的效应分子.Fire et al[1]在1998年向秀丽隐杆线虫中注射双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)分子后降解了细胞质中含有同源序列的靶mRNA.随后的研究表明，RNAi现象广泛存在于真菌、拟南芥、斑马鱼、果蝇、小鼠及大鼠等大多数真核生物中.早期在哺乳动物细胞中应用长dsRNA可引起非特异性干扰素反应而导致细胞死亡，后来遗传学和生物化学研究证明将dsRNA切割成21-28个核苷酸的siRNAs后不引起干扰素反应，并能有效降解含有同源序列的靶mRNA.因此，siRNAs正迅速发展成为研究基因功能的新工具和作为治疗的新手段. 



1 siRNAs的沉默机制 

siRNAs是由RNase-III家族中被称为Dicer的核酸内切酶在细胞质中剪切自然存在的长dsRNA的过程中产生的.Dicer将长dsRNA剪切为21-28个核苷酸的siRNA双链.这种siRNA双链除了在5’末端是磷酸，3’末端是羟基外，3’端还有由2个核苷酸构成的悬突.siRNA双链与诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)结合后裂解为siRNA单链，与siRNA单链完全互补结合的同源性靶mRNA被RISC剪切降解，从而达到基因沉默的目的.现在siRNA能够像核酶一样通过化学合成的方法或者通过载体表达双链短发夹样RNA(short hairpin-like RNA，shRNA)进入到细胞内，后者在细胞内可转化为siRNA而发挥基因沉默效应.一些研究证明siRNAs还有其他沉默机制，例如在几种生物中能够通过RNAi途径修饰细胞染色质导致转录水平的基因沉默[2-3]. 

miRNAs(microRNAs)是一类非编码小分子RNA，具有和siRNAs相似的功能，调节细胞内基因表达.成熟的miRNA是由胞质中70个核苷酸组成的发夹样结构前体剪切为21-22个核苷酸分子组成的单链.他们组装成蛋白复合体(miRNP)后在核糖体内与mRNA3’端非翻译区部分互补结合从而阻止mRNA的翻译.如果与同源性靶mRNA完全互补结合，那么miRNAs像siRNAs一样能够通过正反馈途径循环降解靶mRNA. 



2 siRNAs的基因沉默效率及其安全性 

各种基因沉默的方法是否能够高效作用于靶目标仍然是其应用于治疗的一个关键问题.Harborth et al[4]研究表明RNA结合蛋白，mRNA的二级结构和三级结构能够影响siRNA的沉默效率.绝大多数研究都证实siRNAs比各种寡脱氧核苷酸(oligodeoxyribonucleic acids，ODNs)更有效，并且作用时间更长.作用于同样的靶目标siRNAs的半数最大抑制浓度(IC50)比磷硫酰修饰的ODNs低100-1 000倍.尽管尚未对siRNAs与核酶和/或DNA酶的效率进行广泛地系统性比较，但Drew et al[5]研究表明siRNAs比核酶和/或DNA酶更有效，且具有长发夹结构的RNA比锤头结构的核酶能更强烈的抑制靶基因表达. 

低浓度的siRNAs就能启动基因沉默的过程，因为他们能快速、特异性与RISC结合，从而减少了与非特异性蛋白结合的可能，这有利于减少siRNAs在治疗中的非特异性反应.事实上已有研究证明转染中等浓度的siRNAs并不引起全身非特异性反应[6].也有三项研究[7-9]认为siRNAs引起的非特异性反应与siRNAs的浓度、细胞类型、转染试剂以及siRNAs的转染方式有关.这些非特异性反应包括刺激基因亚型引起的干扰素反应，但研究并非像人们想象的那样，所产生的干扰素反应并不影响细胞生长. 



3 siRNAs的表达载体 

由于siRNAs既可以通过化学合成获得，也可以通过载体表达，这使具有靶向性的药物应用于基因治疗成为可能.表达siRNAs的载体通常含有RNA聚合酶III启动子(RNA polymerase III promoter，pol III)或RNA聚合酶II启动子(pol II)序列，首先转录生成与miRNA前体相似的shRNA，然后在细胞内变成siRNA发挥基因沉默效应.在活体内和培养组织细胞中应用表达siRNA的载体能够长时间整合到基因组中并“敲除”内源性基因.许多研究证明腺病毒载体、腺相关病毒(adeno-associated viral，AAV)载体、逆转录病毒载体及慢病毒载体都能有效转染到活体内和培养细胞中.Shinagawa et al[10]研究表明含pol II的表达载体能在体内产生由数百个碱基对构成的shRNA，而不诱导非特异性干扰素反应，这为siRNAs应用于哺乳动物提供了一种安全的新方法. 


4 siRNAs在活体中的应用 

通过电穿孔、局部注射或静脉注射的方法已经能够成功地将化学合成的siRNAs、表达siRNAs的质粒以及表达siRNAs的病毒导入到哺乳动物细胞中.但很难评价哪种方法能更有效的引起基因沉默.经鼠尾静脉高压注射溶于生理盐水的siRNA已经成功地将siRNA导入大鼠组织中，其中在肝中靶基因的沉默效率达90%以上，而在肺、肾、脾、胰中靶基因的沉默效率稍低[11-12].采用这种方法引起的基因沉默效应一般持续数天，在有些情况下可超过1 wk，并且基因沉默的效率因物种的差异而不同. 

表达siRNAs的病毒载体为研究哺乳动物的基因功能提供了新方法，更为治疗人类主要疾病带来了新希望.已经有几种病毒被设计用于表达siRNAs.重组AAV能在哺乳动物分裂期细胞和静止期细胞中长期表达siRNA.他们通常以附加体的形式随机、低频整合到宿主基因组中.有研究[13]表明向大鼠脑内注射表达siRNA的AAV载体能引起长达7 wk之久的基因沉默效应.在HIV感染的组织模型中表达siRNA病毒载体也被成功地应用于治疗[14]. 

现在又有几种新的方法将siRNAs导入活体内.最近有研究[15]表明大分子能够促进几种小分子物质经皮吸收，包括siRNAs分子.这将有利于siRNAs经皮吸收进入全身血液循环发挥治疗性药物的作用.将含siRNAs的气溶胶导入肺内也能起到基因治疗的作用[16]. 



5 以siRNAs为基础的基因治疗 

虽然siRNA在哺乳动物细胞中的应用仅仅4 a，但他正以飞快地速度发展成为基因治疗的一种新方法.如果siRNAs通过尾静脉高压注射能有效到达肝脏，那么他将可以广泛应用于治疗各种肝病.通过沉默肝中内源性凋亡基因的表达，经抗凋亡酶Caspase-8或者抗Fas细胞死亡受体的siRNAs预处理的小鼠能有效预防各种试剂诱导的急性肝功能衰竭;用同样的siRNA也能够治疗已经发生的肝损伤[11-12].siRNAs通过抑制病毒自身或者抑制病毒转录所必须的辅助因子达到抗病毒的目的.将乙型肝炎病毒(HBV)基因组和siRNAs共转染可以有效降低HBV的复制水平和蛋白合成[17].Wohlbold et al[18]证明用siRNAs能有效沉默异常BCR-ABL融合基因表达，而不影响正常c-BCR和c-ABL的转录，这为治疗Ph染色体阳性的慢性粒细胞白血病提供了新方法. 

在血浆中siRNAs双链能抵抗核酸内切酶的降解作用，但这并不意味着他能够稳定地存在于机体内.因为未被修饰的siRNAs不能迅速进入细胞内，或者与血浆蛋白亲和力低而较早地被机体清除.如果不是通过表达siRNAs载体的方法，那么必须经过化学修饰的siRNAs才能更有效的作为基因治疗的手段.有研究[19-20]正通过硫磷酰修饰siRNA提高细胞的摄取能力，从而增强基因沉默的效果.去年美国FDA已批准经过修饰的siRNAs进行临床新药试验，用于治疗与年龄相关的黄斑退行性改变(age-related macular degeneration)的患者[21].最近Soutschek et al[22]经鼠尾静脉注射胆固醇修饰的抗apoB siRNA能有效沉默同源性靶基因的过度表达，并且证实经修饰的抗apoB siRNA导致小鼠胆固醇水平降低的程度与apoB基因敲除小鼠的水平相近，这实现了siRNA作为静脉注射性治疗药物的可能. 

siRNAs作为一种新的基因治疗方法引起了许多研究者的兴趣，在很大程度上是因为其作为细胞内源性基因表达调节物质的低毒性和特异性，另外一方面则是其比ODNs、核酶有更强的基因沉默效率.然而将siRNAs应用于临床治疗还存在一些挑战，如将siRNAs导入细胞内的最佳方法及如何获得更高效率，如何避免脱靶现象及非特异性反应.因此，进一步深入研究RNAi的机制将会丰富我们对基因表达调控的认识，也将有利于基因治疗的实际应用.