系统化生物芯片技术在功能基因组研究中的应用简介

系统化生物芯片技术在功能基因组研究中的应用简介

　　

    二十一世纪高科技领域里最具时代特征的重大进展之一，就是生物芯片技术的发明和它的研究应用。1997年，生物芯片被全球商业界权威刊物美国《财富》杂志评为二十世纪科技史上影响深远的两件事之一[1]。生物芯片技术能够对生物学问题进行量化和高通量的研究，这是以前的技术难以完成的。

  

        2000年，在我国有关专家的积极推动下，由清华大学、华中科技大学、中国医学科学院和军事医学科学院共同出资组建成立了北京博奥生物芯片有限责任公司暨生物芯片北京国家工程研究中心，专门致力于生物芯片的研究、开发和产业化推动[2]。现在我国已经建立了包括北京国家芯片工程中心在内的五个生物芯片研发基地，即上海国家芯片工程中心、西安微检验工程中心、天津生物芯片公司和南京生物芯片重点实验室[3]。

  

        2007年6月北京博奥生物芯片有限责任公司暨生物芯片北京国家工程研究中心的张亮博士在长春作了题为“系统化生物芯片技术在功能基因组研究中应用”的讲座。张亮博士对生物芯片技术从原理、国际研究关注热点、研究应用新进展等多个方面进行了介绍。下面内容以张亮博士讲座内容为线索，进一步检索、梳理、拓展而成。

 

        一、亲和力生物芯片

 

        一般生物芯片亦即微阵列芯片，可以看成是大量生物传感器构成的高密度、二维阵列。生物传感器通过在传感器表面固定生物探针分子，将分析物与探针分子相互作用后产生的信号，经过换能器转换成可以计算机处理的数据信息。微阵列芯片得益于微加工技术，能够在很小的面积上固定数目巨大的生物分子探针，因此可以高通量地进行生物分子相互作用的分析。绝大多数生物芯片分析都是基于生物分子间特异性相互作用进行的，例如基因芯片基于单链DNA链间的碱基互补配对结合进行分析（如图1所示）；蛋白质芯片基于抗原－抗体特异性结合，蛋白质与小分子配体的特异性结合进行分析（如图2所示）——这些芯片又可以称为亲和力生物芯片。

 

        二、MAQC计划研究证明通过精确控制条件生物芯片具有可靠重现性

 

        生物芯片具有体积小而提供信息量大的优点。但是由于加工工艺及分析操作复杂，并且最初的研究没有建立统一标准，不同实验室，不同平台甚至同一平台而操作者不同所得到的实验结果就会大相径庭，导致人们对生物芯片分析结果重现性、可信性的怀疑。面对日益增多的质疑和争论，美国食品和药物管理局（FDA）领导实施了基因芯片质量控制（MAQC）计划，对生物芯片检测数据的重现性、可靠性进行了为期两年的研究[4]。共有来自FDA、大学及Affymetrix等基因芯片公司和试剂生产厂商在内51个组织的137位科学家共同参与了这项研究工作。该研究结果详细报道在2006年9月8日的Nature  Biotechnology刊物上。题为“基因芯片质量控制计划证明基因表达测量具有同平台和平台间的重现性”（The  MicroArray  Quality  Control  （MAQC）project  shows  inter-  and  intraplatform  reproducibility  of  gene  expression  measurments）的报道对同一平台数据重复性、可再现性，平台间数据可比较性，相对精确性及不同平台间相关性等方面进行了讨论，得到如下结论[5]：生物芯片数据具有平台内和平台间的重现性，因此生物芯片技术可以用于基础和应用研究甚至作为临床诊断工具。当然，作为一个比较复杂的操作过程，生物芯片技术必须在精确控制的条件下进行，操作者的素质和水平直接影响着实验结果的好坏。

  

        三、生物芯片技术研究应用点滴

 

        人类基因组计划推动了各种生物基因组测序工作的进展，越来越多的生物全基因组序列被测定并公布，可是这才是解读“天书”的开始。掌握了基因组序列，却不知道基因序列背后所隐藏的秘密——即基因组的功能，就不能真正理解“天书”更谈不上服务于人类。如何从海量的基因序列数据中发掘这些成千上万基因的功能，研究基因在生命过程中所担负的重要角色，成为基因组时代特别是后基因组时代面临的重要课题，亦即功能基因组研究[6]。在这样的背景下，生物芯片技术于20世纪90年代产生并迅速发展为席卷生物、生命科学、医学等等研究、应用领域的一个热点技术，对传统生物分析方法起到了非常大的推动和变革作用。

  

        1、FDA批准上市荷兰Agendia公司的MammaPrint基因表达谱芯片

  

        传统生物分析实验方法研究基因组功能的最大缺点是：孤立、片面研究单独或少数基因在生命过程、疾病发生中的作用，忽视了基因间的相互影响和协同作用。这也是受传统实验方法本身特点所限，因为这些实验往往步骤繁琐而且一次只能完成少数分析。生物芯片技术具有高通量的特点，在一次芯片分析结果上就可能显示出成百上千的基因的信息，而综合、系统地考虑众多数目的基因的变化是成功揭示基因组功能的关键。

  

        2007年2月，美国食品药物管理局（FDA）批准了荷兰Agendia公司的MammaPrint基因表达谱芯片。这是世界上首个被FDA批准上市的基因表达谱分子诊断芯片产品[7]。MammanPrint基因表达谱芯片是一种用于乳腺癌预后诊断的芯片产品，可以预测患者在首次发生癌症的5到10年内乳腺癌复发的可能性[7]。一般乳腺癌通过手术切除治疗后，对于预后效果好坏，是否需要进行化疗或者使用哪种药物治疗等问题，通常只能依靠医生参考一些指标作出经验判断，人为因素影响大。该基因表达谱芯片通过综合分析病人的70个基因表达，能够比较准确地预测病人的预后效果，以便医生决定采取有针对性的治疗方案[7]。

  

        2、生物芯片用于比较基因组杂交（CGH）研究

  

        比较基因组杂交（comparative  genomic  hybridization，CGH）芯片通过检测、比较样品与对照样品的基因组DNA的拷贝数量，可以直观地得到基因组DNA发生变异的位点信息及拷贝数量变化信息。1998年，Pinkel等利用比较基因组杂交（CGH）微阵列芯片技术实现了基因组DNA拷贝数量变化的高灵敏度分析[8]。该工作发表在当年10月份的Nature  Genetics上。基因组DNA片段的扩增或缺失在许多疾病的发生、发展过程中起到重要作用，例如，抑癌基因及原癌基因的缺失或过度表达引起了癌症的发生[8]；另外，同一物种的不同亚型含有不同的基因表型。因此，比较基因组杂交芯片可以用于肿瘤等疾病的诊断，肿瘤遗传学研究，以及对同一物种的不同亚型进行准确分型等等。比较基因组杂交芯片的检测过程主要如下：将样品及参照样品基因组DNA进行处理，并标记上不同的荧光基团，混合均匀后与微阵列芯片上DNA探针进行杂交。基因组DNA拷贝数量即与杂交后芯片上样品与参照样品荧光强度比值有关，如果样品的基因组DNA某序列下调，则该序列位置处样品荧光要弱于参照样品的荧光，反之则强于后者[8,9]。

  

        3、生物芯片用于单核苷酸多态性（SNP）研究

  

        人类基因组携带了重要的遗传信息。基因组DNA中单个碱基的置换、缺失或插入是非常普遍的DNA多态现象，人类基因组序列在不同人种、人群和个体之间存在大约0.1%-0.2%的DNA序列差异，即单核苷多态性（single  nucleotide  polymorphism，SNP）[10]。2005年，Altshuler等在Nature上发表了题为“人类基因组单体型图”的工作（A  haplotype  map  of  human  genome）[11]。在来自不同人群的269个DNA样本中，研究者发现至少存在100万种单核苷多态性（SNP）改变，并找到了人类基因组中很多热点区（hotspot，即最易出现SNP的位置）。在热点区基因组容易改变从而发生不同的演化，使人类逐渐进化，或者形成疾病及对疾病的易感性[11]。人类基因组单体型图，特别是热点区的单体型图旨在揭示比较不同个体的单核苷多态性（SNP）分布，以了解个体差异的分子机制。由单核苷多态性（SNP）所引起的遗传多态性与个体惟患疾病种类、程度及个体药物代谢差异都有非常密切的关系。所以，检测单核苷多态性，并且深入了解单核苷多态性等基因变异与疾病发生、发展，个体药物代谢的关系，对于疾病的预测、预防、诊断，有针对性地使用特效药物，合理设计治疗策略以及预后治疗等都有着重要意义[10,12]。用于单核苷多态性检测的基因芯片可根据需要，固定覆盖全基因组50万个SNP的探针，将样品基因组DNA酶切、扩增后进行荧光标记，并与芯片上的探针杂交，分析结果就可以得到单核苷多态性的分布及表达量[13]。

  

        4、利用生物芯片测定MicroRNA实现精确的肿瘤分子分型

  

        microRNA  (miRNA)是一类长度很短的非编码调控单链小分子RNA。它由基因组DNA编码、通常长度约20～24个核苷。microRNA是由一段具有发夹环结构，长度为70～80个核苷的单链RNA前体（pre－miRNA）剪切后生成[14]。研究发现，microRNA与siRNA有相似之处，但也有很大不同。siRNA即小干扰RNA（small  interfering  RNAs）可以诱导与siRNA单链序列完全互补结合的靶mRNA被酶降解，从而抑制该基因的表达，即基因沉默[15]。siRNA是人工合成，外源性的能够沉默特定基因的小分子RNA。而microRNA是哺乳动物细胞内广泛存在的，能够调节许多基因表达的小分子RNA[14]。microRNA主要通过降解mRNA和抑制翻译两种方式调控生物体内的基因表达，在动植物的生长发育、细胞的分化和凋亡以及人类疾病的发生（如肿瘤）等过程中发挥着重要的调控作用[14，16]。2005年，Lu等在Nature上发表题为“microRNA表达谱用于癌症分类”(MicroRNA  expression  profiles  classify  human  cancers)的报道[17]。研究人员系统分析了217个哺乳动物的microRNA，发现肿瘤细胞中各种microRNA的拷贝量与正常细胞相比普遍下调。利用microRNA表达谱，他们成功地对难以区分的肿瘤进行了准确分类，而利用mRNA表达谱则无法实现分类[17]。最近，Zhang等发表了题为“microRNA在肿瘤发生过程中作用”（MicroRNAs  in  Tumorigenesis：A  Primer）的综述[18]。文中指出microRNA的特殊功能与肿瘤发病机理密切相关，使其在肿瘤的分类和预测方面都具有重要价值。所以通过测定microRNA可以实现精确的肿瘤分子分型，以便掌握肿瘤个体差异,准确有效地用药。由于动植物细胞内microRNA序列众多，例如已知的人的成熟microRNA有近600个之多，小鼠、大鼠的成熟microRNA分别为350多个及230多个[16]。所以要系统考查如此数目众多的microRNA的表达情况,必须借助高通量的实验手段，基因芯片技术就是非常适合的方法。首先根据已知的microRNA序列设计制备合适的microRNA芯片，一般是含有几百个RNA探针的阵列。分离样品的低分子量RNA进行荧光素标记，然后和芯片上的探针杂交，获取荧光信号，分析结果得到microRNA表达信息[16]。

  

        结语

  

        生物芯片技术的出现给传统生物分析研究带来了巨大变革。经典分子生物学往往研究个别基因的作用。随着人类基因组计划的完成，庞大的基因组DNA序列被揭示，但是基因组相关的很多功能仍是未解之迷。要从海量的基因序列数据中发掘这些成千上万基因的功能，研究基因在生命过程中所担负的重要角色——亦即功能基因组研究，依靠经典分子生物学等传统的生物分析方法已经远远不能满足要求。生物芯片技术具有高通量的特点，对于需要同时、系统分析很多基因的功能基因组的研究是非常有力的工具。

  

        参考文献

        [1]http://money.cnn.com/magazines/fortune/fortune_archive/1997/03/31/224035/

index.htm

        [2]http://most.gov.cn/ztzl/jqzzcx/zzcxcxzzo/zzcxcxcg/zzcxgncxcg/200505/t20050

513_21537.htm

        [3]  http://www.istis.sh.cn/hykjqb/wenzhang/list_n.asp?id=1634&sid=2

        [4]  http://www.fda.gov/nctr/science/centers/toxicoinformatics/maqc/

        [5]  MAQC  Consortium，The  MicroArray  Quality  Control  （MAQC）project  shows  inter-  and  intraplatform  reproducibility  of  gene  expression  measurments，Nature  Biotechnology，2006，24,  1151－1161  

        [6]  陈竺，李伟，俞曼，熊慧，陈赛娟，人类基因组计划的机遇和挑战：1从结构基因组学到功能基因组学，《生命的化学》1998年18卷5期，5－13页

        [7]  http://www.fda.gov/bbs/topics/NEWS/2007/NEW01555.html

        [8]  Pinkel  D  et  al,  High  resolution  analysis  of  DNA  copy  number  variation  using  comparative  genomic  hybridization  to  microarrays，Nature  Genetics，1998，20，207-211

        [9]  http://www.capitalbio.com/Exhibit/exhview1.asp?pid=223

        [10]  http://genetics.gsk.com/link.htm

        [11]  Altshuler  D,  Brooks  LD,  Chakravarti  A,  Collins  FS,  Daly  MJ,  Donnelly  P,  A  haplotype  map  of  the  human  genome，Nature，2005，437，1299－1320

        [12]  http://genetics.gsk.com/determin.htm#SNPs

        [13]  http://www.capitalbio.com/Exhibit/exhview1.asp?pid=222

        [14]  华友佳，肖华胜，microRNA研究进展，《生命科学》2005年17卷3期，278－281页

        [15]  http://www.bioon.com/experiment/rna6/62935.shtml

        [16]  http://www.capitalbio.com/Exhibit/exhview1.asp?pid=242

        [17]  Lu  J  et  al，MicroRNA  expression  profiles  classify  human  cancers，Nature，2005，435，834－838

        [18]  Zhang  WY，Dahlberg  JE，Tam  W，MicroRNAs  in  Tumorigenesis：A  Primer，American  Journal  of  Pathology，2007，171，728－738