姚杰博士三种技术发现新机制

　　

生物通报道：来自康奈尔大学应用与工程物理学院（School of Applied and Engineering Physics），分子生物学与遗传性学系的研究人员先后通过三种技术方法发现基因转录的新机制，即将DNA片段的信息通过精巧的机制转换成mRNA链的细胞特殊“转录制造厂”并不是固定的。相反，RNA合成酶II（RNA polymerase II，Pol II，生物通注）和其它关键分子能在一个活性基因位点处组装，无论这个基因处在什么位置。这一研究成果公布在12月28日的《Molecular Cell》杂志上。

这项研究由分子生物学与遗传学专家John T. Lis领导完成，文章第一作者是康奈尔大学在读博士姚杰（Jie Yao，音译，生物通注），这三种技术分别是多光子显微（Multiphoton microscopy）技术，荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization）和光脱色荧光恢复技术(fluorescence recovery after photobleaching，FRAP）。

一般认为基因转录的分子机器——将DNA片段的信息通过精巧的机制转换成mRNA链——在细胞核的特殊“转录制造厂”是固定的，即细胞在细胞核固定位置进行转录，然而研究人员利用一种新技术：多光子显微（Multiphoton microscopy）技术发现认为基因的活性并不依赖于特定的位点，即所谓的“转录制造厂”。

他们在多线染色体中激活了热激基因——用于保护细胞免受温度突然增高的伤害，之后从转录一开始就实时追踪这些基因，并且研究人员也用荧光标记标记了Pol II，用以追踪其在细胞核中的移动情况。

为了验证这一研究结果不仅适用与多线染色体，也适用与正常染色体，研究人员又利用了一种称为荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，生物通注）的技术，这种技术可以帮助研究人员追踪组装好的细胞染色体中的特殊DNA序列。

在对共调控热激蛋白（即同时转录的基因，生物通注）位点的研究过程中，研究人员发现在热激基因还没有相互靠近之前，不同位点的共调控基因会在热激之后相互配对，而在多线染色体中，基因并不会移动到转录的某一单一位点。

进一步，研究人员利用光脱色荧光恢复技术(fluorescence recovery after photobleaching FRAP，生物通注）发现随着时间推移，Pol II开始随着活性基因新形成的“小室”循环工作。
（生物通：万纹）

名词解释：

1.多光子显微（Multiphoton microscopy）技术

结合多光子荧光技术，多光子共聚焦显微镜（Multiphoton Excitation－MPE）的发展成功的解决了传统共聚焦显微镜（单光子共聚焦显微镜）所存在的问题，MPE的激光源是超快激光器（多为钛宝石激光器，可以达到皮秒或者飞秒级的扫描速度），具有非常高的峰值功率和较低的平均功率，从而可以减小或者消除光漂白和光毒作用。多光子的吸收现象是非线性效应，只发生在聚焦焦点处，不需要共聚焦孔径光阑滤光，从而大大提高成像亮度和信噪比。在传统激光共聚焦显微镜中，光通过出的所有样品都被激发，所以必须用孔径光阑来选取焦点处样品发出的荧光。孔径光阑不仅遮挡了焦点以外样品发出的荧光，而且也遮挡了焦点处散射和漫反射的荧光。在MPE中，焦点处发出的所有荧光，包括散射和漫反射的荧光都可以被收集并探测到。并且由于多光子实验所用的激发光的波长较长，激发光的散射损失很小，轴向分辨率更高，样品的穿透能力更强。

2.荧光原位杂交技术(Florescence In-Situ Hybridization简称FISH)

FIS是一种利用非放射性的荧光信号对原位杂交样本进行检测的技术。它将荧光信号的高灵敏度、安全性，荧光信号的直观性和原位杂交的高准确性结合起来，通过荧光标记的DNA探针与待测样本的DNA进行原位杂交，在荧光显微镜下对荧光信号进行辨别和计数，从而对染色体或基因异常的细胞、组织样本进行检测和诊断，为各种基因相关疾病的分型、预前和预后提供准确的依据。自20世纪80年代末，Pinkel和Heiles将FISH技术引入染色体检测领域后，FISH技术就在临床诊断及科研工作中得到了广泛的运用，显示出与一些传统技术相比的明显优势。

3.光脱色荧光恢复技术(fluorescence recovery after photobleaching FRAP)


研究膜流动性的一种方法。首先用荧光物质标记膜蛋白或膜脂, 然后用激光束照射细胞表面某一区域, 使被照射区域的荧光淬灭变暗形成一个漂白斑。由于膜的流动性,漂白斑周围的荧光物质随着膜蛋白或膜脂的流动逐渐将漂白斑覆盖，使淬灭区域的亮度逐渐增加, 最后恢复到与周围的荧光光强度相等。

细胞膜蛋白的标记方法有很多种。可以用非特异性的染料,如异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)将细胞膜蛋白全部进行标记。也可用特异性的探针,如荧光抗体,标记特异的膜蛋白。膜蛋白一旦被标记就可用激光束进行局部照射处理,使荧光脱色,形成直径约为1μm的白斑。若是可移动的膜蛋白,则会因蛋白的移动,使白斑消失,若是不能移动的蛋白.则白斑不会消失。

根据荧光恢复的速度, 可推算膜脂的扩散速度为每秒钟为几个微米，而膜蛋白的扩散速度变化幅度较大，少数膜蛋白的扩散速度可达到膜脂的速度，大多数蛋白的扩散速度都比膜脂慢，还有一些膜蛋白完全限于某一个区域。正是这种限制，使膜形成一些特定的膜微区(membrane domain),这些微区具有不同的蛋白组成和功能。这实际上是膜蛋白不对称分布带来膜功能的不对称。

FRAP技术也有它的不足之处。第一,它只能检测膜蛋白的群体移动,而不能观察单个蛋白的移动。其次,它不能证明膜蛋白在移动时是否受局部条件的限制。为了克服这些不足,发展了单颗粒示综(single-particle tracking,SPT)技术,可以用抗体金(直径15～40 nm)来标记单个膜蛋白,然后通过计算机控制的摄像显微镜进行观察。