定位候选克隆技术:从疾病到基因[创新技巧]

【字体: 时间:2008年11月03日 来源:生物通

编辑推荐:

  如何将疾病这种表型与基因关联起来呢?定位候选克隆技术就是这样一座桥梁,它被认为是是目前最有发展前途的基因定位策略。它克服了经典的定位克隆纯粹依靠连锁分析进行染色体定位的繁琐而缓慢的弊端,大大加快了克隆工作的进程,而且它也不仅仅局限于遗传病,现在已更多地运用于肿瘤易感基因的克隆。

如何将疾病这种表型与基因关联起来呢?1986年剑桥大学的Alan Coulson首先提出了定位克隆(position cloning)的概念。根据功能基因在基因组中都有相对较稳定的基因座,利用连锁分析将基因定位到染色体的某个具体位置,再通过构建高密度的分子连锁图,找到与目的基因紧密连锁的分子标记,不断缩小候选区域进而克隆该基因,并阐明其功能和疾病的生化机理。不过,定位克隆也存在一定的局限:需要构建跨叠克隆群和精细遗传图谱,耗费大量的人力、物力和时间。因此,人们也试图不断改进它。

定位候选克隆 (positional candidate cloning)就是定位克隆的一种改进方法,被认为是目前最有发展前途的基因定位策略。它克服了经典的定位克隆纯粹依靠连锁分析进行染色体定位的繁琐而缓慢的弊端,大大加快了克隆工作的进程,而且它也不仅仅局限于遗传病,现在已更多地运用于肿瘤易感基因的克隆。

此法是将图谱的一系列标记与连锁分析相结合,把与遗传病有关的基因定位到图谱的某一区域,然后,利用已有数据查找到定位于此区域的所有已克隆的基因或cDNA,快速筛选染色体上与致病基因相关的可能位置,从中克隆出相关的致病基因,再对这些编码的蛋白质进行功能分析并与相应的疗程及症状做比较,找到最可能的候选致病基因,对患者的染色体进行细胞学检查,利用突变基因动物模型与疾病的一致性,最终确定该候选基因是否是致病基因。

定位候选克隆包括三个基本步骤:染色体区域定位、候选cDNA(或EST)获得、全长cDNA及基因结构功能分析和鉴定。

1、染色体区域定位
定位候选克隆的基因区域定位多采用PCR法、FISH技术、染色体显微切割和辐射图谱等方法筛选致病基因(包括肿瘤易感基因)的基因组杂合性丢失(loss of heterozygosity, LOH)的高频率区,从而对致病基因进行定位候选克隆。

所谓杂合性缺失即染色体某一基因座上的等位基因之一出现缺失或突变,使同源染色体相同位置上的基因呈杂合状态。杂合性缺失是肿瘤细胞中一种常见的染色体变异,往往丢失的片段中包含着与肿瘤相关的基因。其中,抑癌基因杂合缺失是导致肿瘤产生的一个主要因素,通常在杂合性缺失的高频区域含有一个或多个抑癌基因,利用图谱上的各种标记(如STS、MS等),通过PCR等方法检测肿瘤样本中染色体的杂合缺失情况,杂合性缺失的高频区域即是基因的候选位置,通过指示标记定位疾病基因。荧光原位杂交(FISH)可对染色体的易位缺失等变异进行高灵敏度检测。

2、致病基因的候选cDNA筛选
在致病基因被介定于狭窄的DNA重叠克隆区域的基础上,对该区域中的基因位点进行测序,将变异位点的核苷酸序列与正常序列进行比较,可确定致病基因的位置。随着区域性 基因图谱的构建和标记位点的增多,从相互重叠的克隆群中筛选候选cDNA即筛选致病基因的表达序列和基因定位的步伐会大大加快。目前cDNA筛选策略主要有以下三种:

第一是依赖cDNA文库的方法,包括直接筛选法(directed selection)和cDNA选择法(cDNA selection)。①直接筛选法是用基因组DNA直接从cDNA文库中通过杂交筛选位于该基因组片段 内的cDNA。②cDNA选择法恰恰与直接筛选法相反,它把基因组的DNA固定在膜上,用总cDNA与之杂交,用PCR从中收集与基因组片段结合的cDNA片段。直接筛选法的优点在于避免了对候选区域大片段地亚克隆操作,且在单一的筛选中可以获得多个转录子的信息,但大片段的纯化、标记较困难。cDNA选择法的最大优越性就在于PCR的介入,大大提高了选择的灵敏度,可以检测到一些稀有转录子。

第二是依赖特征序列的方法。依据转录子内部及其两侧的序列特征直接从基因组DNA中分离cDNA片段,主要有CpG岛搜寻法、外显子捕获法、交叉物种序列同源性比较法和直接序列分析法等。

第三是表达依赖法,即Northern杂交分析法。用候选区域基因组DNA作为探针与总RNA进行杂交,切下阳性条带,反转录成cDNA并克隆,即可获得位于此基因组片段中的转录子。

3、全长cDNA及基因结构与功能分析和鉴定
获得了大量的候选cDNA后,通过筛选cDNA文库或采用cDNA末端快速扩增(RACE)等方法克隆全长基因。确定其中致病基因的重要环节是对定位候选克隆进行功能分析,这需要对患病家系中的可能致病基因进行检测。

中国科学院遗传与发育生物研究所李巍研究员长期从事囊泡运输与细胞器发生的分子细胞生物学机制研究。具有代表性的囊泡运输障碍性疾病是Hermansky-Pudlak综合征(HPS)。他已经利用定位候选克隆技术鉴定了16个小鼠和8个人的HPS基因。已知这些HPS蛋白之间可形成不同的复合体(AP-3,HOPS,BLOC-1,BLOC-2,BLOC-3等)和互作网络,参与囊泡运输过程。今年9月,他还利用这项技术发现了白化病的4个关键基因。

如果大家想了解定位候选克隆技术的更详细过程,不妨参看李巍研究员的论文。(生物通 薄荷)

订阅生物通快讯

订阅快讯:

最新文章

限时促销

会展信息

关注订阅号/掌握最新资讯

今日动态 | 人才市场 | 新技术专栏 | 中国科学人 | 云展台 | BioHot | 云讲堂直播 | 会展中心 | 特价专栏 | 技术快讯 | 免费试用

版权所有 生物通

Copyright© eBiotrade.com, All Rights Reserved

联系信箱:

粤ICP备09063491号