绿色荧光蛋白的前生今世

【字体: 时间:2008年10月10日 来源:生物通

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  今年的诺贝尔化学奖揭晓,与GFP有关。GFP大家都不陌生,细胞中散发着点点绿光,煞是好看。1962年被发现,1992年被克隆,中间隔了30年。而它在生物界中被广泛应用,也就是这十几年的事。GFP到底有着怎样的前生今世?

  

2008年10月8日,诺贝尔化学奖揭晓。日本科学家下村修、美国科学家马丁•查尔非和钱永健因发现和改造绿色荧光蛋白(GFP)而获奖。GFP大家都不陌生,细胞中散发着点点绿光,煞是好看。1962年被发现,1992年被克隆,中间隔了30年。而它在生物界中被广泛应用,也就是这十几年的事。GFP到底有着怎样的前生今世?

让我们先来了解一些关于GFP的基本知识。GFP由238个氨基酸组成,分子量为26.9 kDa,最初是从维多利亚多管发光水母中分离出来的,在蓝光照射下会发出绿色荧光。来源于水母的野生型GFP在395 nm和475 nm分别有主要和次要的激发峰,它的发射峰在509 nm,处于可见光谱的绿色区域(图1)。来源于海肾的GFP只在498 nm有单个激发峰。

GFP是典型的β桶形结构,包含β折叠和α螺旋,将荧光基团包含在其中(图2)。严密的桶形结构保护着荧光基团,防止它被周围环境淬灭,内部面向桶形的侧链诱导Ser65–Tyr66–Gly67三肽环化,导致荧光基团形成。

1962年,下村修和约翰森从维多利亚多管水母(Aequorea victoria)中分离生物发光蛋白-水母素(aequorin)时,意外地得到了一个副产物。它在阳光下呈绿色、钨丝下呈黄色、紫外光下发强烈绿色。其后他们仔细研究了其发光特性。1974年,他们得到了这个蛋白,当时称绿色蛋白、以后称绿色荧光蛋白(GFP)。GFP在水母中之所以能发光,是因为水母素和GFP之间发生了能量转移。水母素在钙刺激下发光,其能量可转移到GFP,刺激GFP发光。这是物理化学中已知的荧光共振能量转移(FRET)在生物中的发现。

研究者们并没有意识到GFP的应用前景,慢慢就将其遗忘了。这一晃就是20年。直到1992年,道格拉斯•普瑞舍克隆并测序了野生型的GFP,文章发表在《Gene》杂志上。但具有讽刺意味的是,基金评审委员会认为普瑞舍的工作没有意义,不愿提供经费。普瑞舍一气之下,离开了科学界,将GFP的cDNA送给了几个实验室。很多人尝试用GFP的基因来表达蛋白,但都失败了。马丁•查尔非就考虑只用它的编码区域来表达。他用PCR的方法扩增了GFP的编码区,将它克隆到表达载体中,通过UV或蓝光激发,在大肠杆菌和线虫细胞内均产生了很美妙的绿色荧光。这才是GFP作为荧光指示剂的真正突破,文章发表在《Science》杂志上。

尽管野生型GFP发出很绚丽的荧光,但它还是有不少缺点,比如有两个激发峰、光稳定性不好,在37℃不能正确折叠。

1996年Remington小组最先在《Science》上发布了GFP的S65T突变体的晶体结构。一个月后,Phillips小组也在《Nature Biotech》上发布了野生型的GFP结构。正是这些晶体结构的探明,才使人们更好地了解发光基团的组成,以及与周围残基的相互作用。研究人员通过定点或随机突变,不断地改造这些残基,得到了我们今天使用的GFP衍生物。

首个重大改变就是钱永健在1995年完成的单点突变(S65T)。这个突变显著提高了GFP的光谱性质,荧光强度和光稳定性也大大增强。突变后的GFP激发峰转移至488 nm,而发射峰仍保持在509 nm,这和常用的FITC滤光片匹配,提高了GFP的应用潜力。而F64L点突变则改善了GFP在37℃的折叠能力,综上就产生了增强型GFP,也就是我们常见的EGFP。

其他的突变还包括颜色突变,这其中大部分也是钱永健的功劳(图3)。现在有蓝色荧光蛋白(EBFP, EBFP2, Azurite, mKalama1)、青色荧光蛋白(ECFP, Cerulean, CyPet)和黄色荧光蛋白(YFP, Citrine, Venus, Ypet)。蓝色荧光蛋白除mKalama1外,都包含Y66H替换。青色荧光蛋白则主要包含Y66W替换。YFP衍生物是由T203Y突变实现的。另外,还有对pH敏感的突变体如pHluorins。

荧光蛋白广泛应用于生物学研究。通过常规的基因操纵手段,将荧光蛋白用来标记其他目标蛋白,这样可以观察、跟踪目标蛋白的时间、空间变化,提供了以前不能达到的时间和空间分辨率,而且可以在活细胞、甚至活体动物中观察到一些分子。荧光蛋白技术也使得人们可以研究某些分子的活性,而不仅仅是其存在与否。(生物通 余亮)

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