蛋白样品制备全攻略[选购宝典]

【字体: 时间:2008年11月10日 来源:生物通

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  双向电泳可不是一件容易的差事,花银子花时间不说,结果还很难重复。想要搞定双向电泳,关键在于建立一套有效、可重复的样品制备方法。蛋白方面的专家Bio-Rad公司提供了一系列的产品和方法,让蛋白样品制备更轻松。

双向电泳可不是一件容易的差事,花银子花时间不说,结果还很难重复。想要搞定双向电泳,关键在于建立一套有效、可重复的样品制备方法。方法是多种多样的,不过都基本遵循以下的原则:

1. 样品缓冲液中离子浓度的控制
2. 溶解包括疏水蛋白在内的所有蛋白质
3. 防止聚焦过程中已溶解蛋白质的聚焦和析出
4. 防止样品制备过程中及其后蛋白样品的酶或化学降解等的修饰反应
5. 去除或完全降解核酸及其他干扰分子
6. 去除高丰度或不相关的蛋白质,提高低丰度蛋白的浓度,使其达到检测要求

提高分辨率和确保重复性是双向电泳实验最重要的两个目标。蛋白样品制备在实现这两个目标的过程中起到了核心作用。Bio-Rad公司的ReadyPrep试剂盒通过试剂增溶或差异溶解来减少脱尾或降低样品复杂性,从而成为用户可靠的实验工具。ReadyPrep 产品线包含一系列2-D 样品制备试剂盒,不仅适用于通用样品(总蛋白)处理,而且可以将复杂样品按特定方法分级。处理通用样品的试剂盒包括总蛋白抽提和蛋白净化(clean-up)。样品分级试剂盒可用来降低样品复杂程度,同时有助于低丰度蛋白的富集和鉴定。这类试剂盒又分为两种,一种是基于蛋白不同的亚细胞定位来分离,另一种是对细胞总蛋白进行分级,从而适合于总蛋白质组分析。

从血清或血浆中提取的低丰度蛋白经常会受到白蛋白和IgG的干扰。白蛋白在血清总蛋白中的含量约为60-70%,IgG虽小,也不可轻视,占了总蛋白的约10-20%。这两种蛋白异军突起,常常掩盖了其它类似大小的蛋白,使我们无视低丰度蛋白的存在,也降低了双向电泳的分辨率。因此,在分析目的蛋白之前,我们一定要先干掉白蛋白和IgG这两个家伙。

样品中的核酸会对等电聚焦的结果产生干扰:DNA复合物在变性条件下发生解离而使溶液的粘稠度增加,可阻碍蛋白质进入IPG胶条,并减慢蛋白质在胶条中的移动速度。DNA也会与样品中的某些蛋白质结合,出现人工假象和条纹。

具体的解决方案如下:

去除盐分、去垢剂、脂类、酚类

ReadyPrep 2-D 净化试剂盒
ReadyPrep 2-D 净化试剂盒可去除蛋白样品中的去垢剂、盐分、小肽、脂类和酚类化合物。这些物质会干扰双向电泳。本试剂盒含有不受去垢剂、离液剂或其它实验中常用试剂干扰的沉淀试剂,可充分沉淀样品蛋白,并保证了蛋白样品的回收效率和浓度。

去除白蛋白

Aurum Affi–Gel 蓝胶小型试剂盒和层析柱
通过亲和层析,Affi–Gel 蓝胶能去除血清和血浆中90%的白蛋白。

去除白蛋白/IgG

Aurum 血清蛋白Mini试剂盒
Aurum 血清蛋白Mini试剂盒包含了Micro Bio-Spin层析柱,其中填充了Affi-Gel 蓝胶和Affi-Gel Protein A填料。这两种树脂混合物能同时选择性地结合白蛋白和IgG,处理过的样品无需额外纯化,就能立即用于2D的分析。一次纯化就能搞定两个东西,操作步骤减少了,效率也提高了。

去除DNA

最简单的方法就是酶解。当样品用高pH溶液裂解后,在溶液中加入核酸内切酶,既能有效降解核酸,又能使内源性蛋白酶的活性最低。也可以在冰浴环境中,通过超声处理的方法将大片段的核酸打断成小片段后,直接进行双向电泳。

总蛋白抽提

ReadyPrep 蛋白抽提试剂盒 (总蛋白)
ReadyPrep 蛋白抽提试剂盒 (总蛋白) 是一种操作简单、快捷、重复性好的试剂盒,用来抽提适合于双向电泳的细胞全蛋白。试剂盒中离液性超强的抽提溶液含有兼性去垢剂ASB-14,从而使该溶液能溶解各种细胞的全蛋白。

根据亚细胞定位分步抽提

ReadyPrep蛋白抽提试剂盒 (膜I)
本试剂盒是利用Triton X-114在一定温度下可与水相分层的原理将蛋白分离。经过最后一步的离心步骤,溶液被分级成上层的水相和下层的高去垢剂相。此外还有一些难溶的沉淀,这些沉淀主要是更加复杂的膜蛋白。进入上下两相的蛋白再用ReadyPrep 2-D 净化试剂盒(含在本试剂盒中)净化,以去除抽提过程中混入的可能干扰IEF的物质。

ReadyPrep蛋白抽提试剂盒 (膜II)
膜II试剂盒做为其它膜蛋白分离试剂盒的补充,是专门为有效分离较为复杂的膜蛋白而优化的。抽提的过程用到了碳酸钠和超速离心机。试剂盒中的2-D水化/上样缓冲液含有强离液性的兼性去垢剂ASB-14。

ReadyPrep 蛋白抽提试剂盒(信号)
绝大多数细胞的胞浆膜都有富含神经鞘磷脂和胆固醇的微区域(酯筏)。与这些脂筏相联系的蛋白往往是参与物质跨膜转运或信号转导的蛋白质。这类蛋白包括GPI锚订蛋白、caveolin、caveolae (caveolin-associated proteins)、酰化酪氨酸激酶、G蛋白异三聚体,以及一些含跨膜结构域的蛋白 (Simons and Ikonen 1997, Brown and Rose 1992, Parton and Simons 1995, Anderson et al. 1992) 。与胞膜当中这些富含酯类的微区域相结合的蛋白质在4°C Triton X-100的溶液中难溶。ReadyPrep 蛋白抽提试剂盒(信号) 利用这一原理将信号蛋白有选择性地加以回收。

ReadyPrep蛋白抽提试剂盒(胞浆/核)
ReadyPrep蛋白抽提试剂盒(胞浆/核)使用一种专门配制的缓冲液和差速离心将细胞核完整地分离出来(Dignam et al. 1983, Zerivitz and Akusjarvi 1989)。本试剂盒包含一种强离液性的缓冲液,可有效溶解膜蛋白,并可直接用于双向电泳分离。如要对胞浆组分进行分析可以将蛋白样品先用试剂盒中带的ReadyPrep 2-D 净化试剂盒处理。

根据不同的溶解度分步抽提

ReadyPrep 顺序抽提试剂盒
ReadyPrep 顺序抽提试剂盒是为全蛋白质组分析而设计的。本试剂盒将初始蛋白样品根据溶解性的不同分成三个组分。当蛋白的亚细胞定位不能确定时,本试剂盒还可以用来搜寻特定的蛋白。 依照溶液溶蛋白能力的增加将蛋白样品进行顺序抽提可以溶解更多的蛋白,从而使蛋白质组的信息更全面。

ReadyPrep 蛋白抽提试剂盒 (可溶/不可溶)
ReadyPrep 蛋白抽提试剂盒 (可溶/不可溶) 可将细胞全部蛋白分为两个组分——以亲水性蛋白为主的可溶性组分和以疏水性蛋白为主的不可溶组分。这种简单的分级方法可有效降低样品的复杂性,提高低丰度蛋白的检测效率,从而在总体上改善总蛋白质组的分离效果。

保持蛋白的还原状态

ReadyPrep还原/烷化试剂盒
ReadyPrep还原/烷化试剂盒首先将半胱氨酸残基之间的二硫键还原,然后将还原出来的巯基烷化,使得这些基团永久保持还原状态。这样做有助于防止假蛋白点的出现并能让IPG胶条中更多的蛋白质转移到第二向的SDS-PAGE胶中。本试剂盒对分析碱性蛋白质特别有效。因为胶条碱性部位的DTT容易电离,在电场作用下迁移出IPG胶条,从而使胶条中DTT减少,蛋白质二硫键重新形成。绝大多数生物含有较多数量的碱性蛋白,这类蛋白的pI值高于pH 7。

要想得到好的双向电泳结果,绝大多数样品都需要通过多次实验才能摸索到最适宜的条件。所以革命尚未成功,同学仍需努力!

(生物通 余亮)

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