2008十大突破：首个脊椎动物的发育蓝图

　　

长期以来，描绘脊椎动物的胚胎发育是一件极其困难的事情。迄今为止，科学家只对2种多细胞有机体做过类似的研究。一种是海鞘，一种是线虫，它们都是用传统的显微镜来完成的。

但是，当传统的显微镜遇上复杂的脊椎动物，就显得有些力不从心了。让我们来比较一下，在线虫胚胎发育时，需要跟踪671个细胞；而分析复杂的脊椎动物胚胎往往要同时追踪几万个细胞。高的时空分辨率、超低的光漂白速率、杰出的信噪比，这些都是追踪的关键。

2008年，这项技术终于有了突破。首个脊椎动物的完全发育蓝图出炉了。德国海德堡欧洲分子生物学实验室（EMBL）的Keller及其同事，利用数字扫描激光荧光显微镜（DSLM），在超过24个小时的时间内监测了斑马鱼胚胎由单个细胞生长成几万个细胞的情况。研究人员用激光显微镜从多个方向扫描了标本，创造了40多万张图片，得到了关于细胞位置、运动及分裂的大量数据，并制成了三维影像。文章发表在2008年10月的《Science》杂志上，并被评为2008年十大科学突破之一。

这个突破的核心是数字扫描激光荧光显微镜的发明。它实现了科学家们多年的梦想。

目前应用最广泛的荧光成像技术是共聚焦和多光子显微镜，它们提供了三维的分辨率，但缺乏了长时间记录胚胎发育中最关键的因素：高速成像、光毒性低。为了打破这些限制，EMBL的研究人员在2004年发明了单层照明显微镜（Single Plane Illumination Microscopy，SPIM）。

SPIM使得科学家能够在模拟实际状况的介质条件下观察较大样本(2mm～3mm)，而无需如操作传统显微镜那样，将样本切割或破坏后固定到载玻片上。它发出极细的一束光穿过样本，通过精心操纵样本在不同光平面中的移动，获取样本每一层的图像。聚焦区域以外没有其他光线，因此SPIM成像非常鲜明，没有通常的背景模糊现象。整个样本可以在显微镜下继续存活生长，这是其他显微镜无法做到的。通过采用细束的光而不是将整个样本瞬间置于强光照射之下，SPIM同时也减小了光致损害，使样本生命得以延长。

在SPIM的基础上，为了改善成像质量、速度和易用性，Keller等开发了新一代的数字扫描激光显微镜（Digital Scanned Laser Light-Sheet Microscope，DSLM）。DSLM的理念是激光扫描仪快速移动，将微米级的激光束垂直和平行地通过样本。

它与标准的光层显微镜相比，具有几个优势。首先，DSLM的每束光强度均一，这对大样本的定量成像非常关键。第二，DSLM不依赖于光圈来形成激光图像，因此减少了光学像差，改善了图像质量。第三，光源的整个照明能力集中在单束光上，照明效率达95%。第四，DSLM能产生密度调节的照明模式（结构化照明），用于增强光线散射度高的样本如大胚胎的图像对比度。另外，DSLM的成像速度为6300万三维像素/秒，信噪比为1000:1，单层的激发能量超低（在斑马鱼实验中488 nm的每幅图像的能量为1.7 uJ）。

在实验中，胚胎包被在琼脂糖中，在整个实验中保持恒温（26.5C）。在单细胞状态时，将H2B-GFP（人组蛋白-2B和GFP报告基因的融合蛋白）的mRNA注射进去，定位染色质。这是细胞定位和细胞分裂的有效标记，在染色质密度发生改变时，能被直接观察到。成像连续进行了24小时，共拍摄了40万张图像。

研究人员观察到稳态的GFP浓度持续了约12个小时。但之后12小时的荧光强度水平保持恒定。这表明DSLM高速活细胞成像中的光漂白速率可以忽略不计。同时他们利用共聚焦显微镜和双光子荧光显微镜进行了同样的实验，能量却高得多（共聚焦为每幅9.6 mJ，双光子荧光显微镜为1.7 J）。因此，DSLM实现了斑马鱼胚胎发育的定量分析，持续时间超过24小时，时空分辨率高而光毒性超低。

说一点题外话，除了DSLM，后续的图像和数据分析任务也是相当艰巨。EMBL用了超过1000个CPU来进行后续分析，花费约8万欧元。他们还运用了国际上流行的matlab软件进行主要的数据处理。因此，这项突破实际上是生物学、工程学和计算机科学的共同结晶。

（生物通 余亮）