专家解答体内荧光成像技术难点[心得点评]

生物通报道：体外荧光显微技术一直以来都是现代生命科学研究的基础之一：给荧光基团配上一个合适的配体，比如抗体或者量子点，然后将其与组织样品或者细胞培养物一起温育，最后加上光照，这样标记的分子就能通过显微镜显示出来。但是体外方法有一个“致命伤”——不能在天然环境下描绘生物过程，因此研究人员逐渐从体外观测转向对体内生物体过程的研究。

体内荧光成像主要由灵敏的CCD及其分析软件和作为报告子的荧光素酶（luciferase）以及荧光素（luciferin）组成，可以直接对活体生物体内的细胞活动和基因行为进行监控，适合于观测活体动物体内肿瘤的生长及转移、感染性疾病发展过程、特定基因的表达等生物学过程。这种方法可以对同一组实验对象在不同时间点进行记录，跟踪同一观察目标（标记细胞及基因）的移动及变化，因此比较于传统的动物实验方法，所得的数据更加真实可信。

然而，尽管这种技术具有操作简单，结果直观，灵敏度高等优点，但是仍然也存在许多问题，任何荧光成像的实验手册也都有一些troubleshooting，比如荧光基团不稳定啊，交联配体的结合特异性差啊，或者信号水平不高等等。这也难怪，因为对于体内成像技术而言，光需要绕很多道“弯”才能到达组织，获得图像，而且由于组织会吸收和散射一些光，因此实验手册都需要确保激发的光源能到达荧光标记物，并且这些荧光也要能从生物体外观测到。更加复杂的是，许多组织本身就是荧光的，所以无论采用的是哪种方法，都需要“对付”这种自发荧光（autofluorescence）的现象。

不过利用一些方法和手段能避免以上的这些问题，这里提及了一些著名实验室采用的方法，以及一些技术上创新的市场产品，如果您在体内荧光成像方面遇到了一些问题，不妨往下看看，他们的问题及解决方法也许也适用于您。

 

1.如何解决组织吸收问题

来自斯坦福大学放射学系助理教授Jianghong Rao领导的研究小组在进行“Examining protease involvement in tumor metastasis and cell migration”（肿瘤转移与细胞迁移过程中涉及的蛋白酶）这一项研究中遇到了一个难题：利用标准的荧光分子标记观测深部组织，激发荧光的光源必须能穿透具有强吸收力和光散射的组织，并且当标记分子发出光时，也要能通过同样的组织块，从而被检测到。

为了解决这个难题，研究人员采用了一种称为生物发光共振能量转移（Bioluminescence Resonance Energy Transfer，BRET）的方法进行组织成像。不同于利用生物体外激发光源的能量转移方法，BRET主要依赖于生物发光的荧光素酶来提供荧光标记需要的能量转移。一般而言，进行BRET实验的研究人员是将与荧光素酶与荧光蛋白相交联，后者会吸收生物荧光，并重新发出光，但是由于这些BRET交联物的光仍然有大部分会被吸收和散射掉，因此剩下的信号依然很弱。

Rao改进了这一方法，他将荧光素酶交联在quantum dots (QDs)，而不是荧光蛋白上，这就将发出的光线变成了依然是长波长，但吸收和散射不强的光。为了能对深部组织进行成像，Rao等人又将luciferase-QD这个结构连接上了一个配体——这个配体与目的分子相连。这样当将底物，复合体（包括荧光素酶的荧光基团）注入小鼠的尾静脉的时候，BRET标记就能发出两种特殊的光：蓝色的生物荧光和红色的quantum-dot光，这样就能更清楚的观测组织。

 

这里Rao用于解决组织吸收问题的是一类新型的荧光探针，即量子点Qdot或称为半导体纳米晶体，所谓Qdot，指的是准零维(quasi-zero-dimensional)的纳米材料，由少量的原子所构成。粗略地说，量子点三个维度的尺寸都在100纳米(nm)以下，外观恰似一极小的点状物，其内部电子在各方向上的运动都受到局限，所以量子局限效应(quantum confinement effect)特别显著。

这种纳米材料对于体内光学成像来说有着得天独厚的光学特点，这就是吸收性高、量子产量高、发射谱带窄、斯托克司频移大以及光褪色抗性强等，能够发射不同波长光谱，可以为单一波长所激发，适用于在一个实验中检测多靶点，因此非常适合活细胞成像和动态研究，甚至有人认为这种纳米荧光是纳米技术的真正代表，给荧光技术带来革命性的突破。

其具体特点如下：

·QDs的发射谱单一而且很“窄”。其半峰宽（FWHM）大都在40nm以下，更好的可以达到30nm甚至十几个nm，因此，QDs作为探针，可以很方便的区别于背景信号或者其它探针的信号。
·QDs的激发谱很宽，可以在低于发射谱的广泛区间内任意选择激发波长。这个属性使得对设备（光源）的选择变得更加方便，而不必受限于特殊激光器。QDs的这个特点还可以让我们在同一固定激发波长下，同时激发不同颜色的QDs，从而使需要实时观测多种目标分子运动或反应的实验变得从容不迫和得心应手。
·QDs的发光强度高。与常用的有机小分子染料相比，QDs的发光强度要高几倍乃至几十倍。这一方面取决于QDs的荧光量子效率，另外也决定于QDs的摩尔消光系数。毋庸置疑，高发光强度能够更为方便地从复杂背景中（如自发荧光）提取需要的信号。
·QDs的稳定性很好。虽然早期的QDs在光学/化学稳定性上不存在非常突出的优势，但近年来技术的改进是QDs的稳定性大幅提高，在生理条件下可以保持几个月而没有明显的衰减。
·QDs表面经过化学修饰，可以携带氨基、羧基、巯基等，可以方便地与选择的生物分子缀合，而不必再为构建探针的策略而惮心竭虑，而这几种化学反应的效率，已经可以足够满足构建探针的要求。
·超高的表面积-体积比允许QDs表面存在丰富的化学基团，为选择构建多功能探针提供了优秀的平台，比如，构建同时具有细胞/组织靶向性、跨膜属性、核定位属性以及治疗特性的QDs生物探针。

 

目前市面上此类染料并不是十分常见，经典的纳米荧光染料主要来自同名注册的公司：Quantum Dot公司，这家公司注册于1998年，创办者是麻省理工学院的Moungi Bawendi和加利福尼亚大学的Paul，这家公司由此在财政上获得3，750万美元的利润，《财富》还将这一项技术列为2003年具有突破性的尖端技术之一。目前这家公司已被Invitrogen以八位数的金额收购了（Invitrogen现在也改名了，合并ABI后将改名为生命技术公司）。

Qdot是Quantum Dot公司革命性的纳米荧光染料，制作过程是将镉和硒一起放在溶液中加热，形成半导体晶体。轻微的改变过程可形成不同大小和组成的晶体，因此他们将发出不同的光。将锌和硫加入混合物，在每一个晶体上形成一个壳，然后晶体包被一层可产生共轭的分子，它们可吸附蛋白。

在显微镜下可以看到这些纳米晶体，细胞中的Qdot在同一光线下呈现多种颜色，显示它们的大小和组成不同。它们比荧光蛋白和染料更明亮，保持时间更长。因此Qdots可以应用于细胞分析，基因表达和医学诊断，通过研究这些与蛋白质相连的发光晶体，还可跟踪这些蛋白质来研究样本中的细胞，另外Qdots还用于分析癌细胞中的基因组成，以及检测治癌药物与其靶细胞结合情况。值得一提的是其相关的专利也有华人科学家的贡献，比如复旦大学生科院的兼职教授，加州大学劳伦斯伯克利国家实验室的陈帆青教授。

Quantum Dot公司相应的Qdot系列产品能满足流式细胞术、荧光显微镜、激光共聚焦、甚至Western Blot的检测需求。价格方面也不是很贵，比如上面Rao博士用的Qdot的价格目前是319美元（250 ml, 8 mM solution），在体内成像方面遇到了相同问题的实验人员可以考虑一下。

另外松下（Matsushita）公司也开发出了用于研究的Qbead微珠的装置，可以配合Qdot的使用，其中多达200个独特标记的微珠吸附在探针上并结合了Qdot，使研究人员可以在一个样品中检测超过200个不同基因。这个系统可以让研究者一天从几千个样品中检测数百个基因。而且这种微珠有足够的灵敏度可检测少至100，000个RNA分子，这比微阵列方法灵敏得多，同时针对Qdot，Matsushita也设计制造出了Quantum Dot Mosaic Q100扫描仪。

 

2.如何解决自发荧光问题

加州大学旧金山分校的博士后Rachel Friedman参与了Matthew Krummel实验室的一项研究：观测在对抗原最初应答的过程中的T细胞受体动力学，但是在成像过程中，研究人员发现炎症反应会将一些非特异性的巨噬细胞和树突细胞吸引到淋巴结附近，而这些细胞会发出其自身的荧光，扰乱他们使用的绿色荧光蛋白发出的光。

为了能排除这些细胞的干扰，Friedman等人采用了双标记的方法，他们在受体小鼠中注射了能表达一种GFP标记抗原受体的T细胞，这个抗原受体能被鸡卵清蛋白激活。由于GFP发出的绿色荧光与周围的自发荧光是相同的，因此研究人员加入了另外一种标记：Cell Tracker Orange，这种“vital dye”能浸入活细胞的细胞膜，结合到只有这种T细胞才表达的一种蛋白上，便于从组织自发荧光区分开来。

然后利用双光子显微技术（2-photon microscopy），Friedman等人同时捕获到了绿色和桔色的信号，其中桔色的染料实际上就是作为了一种阳性背景：当两种发射光同时定位在一个地方，就可以认为此处T细胞被激活了，而不是自身荧光作用。

Friedman说，“T细胞本身的自发荧光很低，因此我们可以肯定这样得到的绿色荧光是由T细胞受体标记发出的。”

 

这里提到的Cell Tracker Orange是一种细胞示踪染料，作为良好的细胞形态学示踪产品，荧光探针或检测分子需具有定位于细胞或细胞器的能力、并在这些结构中长期存在。对于活细胞和组织来说，示踪剂还必须是无生物活性及无毒的。这些条件都满足的情况下，示踪剂才能发挥作用。

来自于荧光产品集大成者：Molecular Probes（现属于Invitrogen）的Cell Tracker系列产品（包括Cell Tracker Orange，Cell Tracker Blue，Cell Tracker Green，Cell Tracker Red等，最大激发波长不同）就是一类经典的荧光示踪染料。这些染料包含有氯甲基基团（见下），体外实验显示参与GST反应，能与硫醇相互作用，在大多数细胞中，谷胱甘肽的表达水平都比较高，并且谷胱甘肽转移酶也随处可见，因此这种染料添加到细胞培养物中，经过洗涤进入细胞，能在细胞中能存留多代，并不会转移到该群的其他细胞中去（仅有很小可能会通过缝隙连接转移）。这种探针在荧光染料的细胞存留能力上实现了一个突破，用于移植细胞和组织的长时间示踪非常理想。

（图示说明：CellTracker Green CMFDA试剂两个细胞内反应。虽然染料可能首先与谷胱甘肽相互反应，但是并不会发出荧光，只有当与酯酶esterase相互作用的时候，才会发出荧光，如图中的第一个反应。）

Cell Tracker Orange (1 mg, Invitrogen) 的价格大约为208美元，其它颜色产品请询问厂家价格。

另外一些成形的系统也可以通过不同波长的激发光来减少自发荧光的影响，比如颇为出名的Xenogen的IVIS系统就可以检测波长范围400－950nm的荧光，通过六块不同的激发光滤镜获得所需的特定激发光波长。光线通过第二块蓝色漂移背景光滤镜(blue-shifted background filters)，使得初始的激发光产生轻微的蓝色漂移。以不同波长的激发光，在不激发荧光报告基团时激发组织的自发荧光，从而将靶信号与背景光区分开，消除自发荧光 。

今年LI-COR公司推出的Pearl Imager活体成像系统则是通过其独特的近红外荧光优势减少了自发荧光的影响。

光的吸收和散射很大程度上取决于激发光源，通常由于生物活体内的很多物质，譬如血红素，黑色素以及脂质对于激发光具有一定的吸收度，而这种吸收度是随着激发荧光波长的不同而变化的，波长越长，活体对于光的吸收和散射程度越低。而在大于900nm波长的红外光下，吸水性又会导致高的背景噪音。Pearl Imager采用的近红外荧光则取巧的选择了近红外这个波长范围，在这个区域，活体内物质自发荧光对于成像干扰小，背景噪音也不大，因此可以说近红外荧光染料基团是比较理想的动物活体成像标记物质。

Pearl Imager就是利用了这些报告基因，比如IRDye 800CW, Cy7, and Alexa Fluor 750，再配上灵敏的CCD光学检测仪器，从而成就了这样一种灵敏高效的荧光成像系统。

 

3.如何减少非特异性结果影响

哈佛大学医学院Charles Lin博士在研究循环系统癌细胞进入组织过程中血管上皮细胞黏附分子的作用的时候，发现免疫荧光标记有可能不会结合到特异性抗原上，而是绑定在靶标上。在体外成像实验中有个步骤是洗涤，即最小化非特异性结合的影响，但是在体内这是无法完成的。

为了解决这个问题，Lin博士设置了一个针对非特异性结合的有效对照，他表示，体外免疫荧光实验的原理类似于三明治，即荧光基团结合在二抗上，而二抗可以与抗原-抗体复合物相互结合。但是在体内成像过程中，荧光基团是直接交联在抗体上的，这样能减少了动物模型中化学反应的复杂度。

由于抗体-荧光基团交联物一般不能通过购买获得，因此研究人员需要自己准备。Lin博士建议设置的对照指的是同型对照（isotype control），即交联另一种颜色荧光基团的抗体，这个抗体与特异性抗体基本相似，但是没有与靶标抗原特异性结合的Fab位点。他说，“理论上说，同一个动物模型可以注入特异性和非特异性的免疫荧光基团，这两种基团颜色不同”，这样不仅可以将背景信号分离出来，而且可以确保在实验中示踪靶标的特异性。

 

4.如何解决多重问题

来自多伦多大学的医学物理学教授Brian Wilson研究小组的一项研究项目是通过识别和定量脑癌组织，来帮助进行肿瘤切除手术的外科医生确定癌细胞是否还有残留。

但是在研究中，Wilson一下子遇到了三个难题：背景自发荧光遮盖了信号荧光；光吸收和散射减少了激发和发射光强度；光来源和照相系统的位置，角度和距离都会影响检测强度。

为了能解决这三个问题，Wilson利用了一个内生性的荧光基团：原卟啉IX（Protoporphyrin IX，PpIX）作为荧光标记。PpIX是由ALA经ALA脱水酶等一系列酶作用下，生成的具有强光敏作用的一种分子，是血红素生物合成的最后一步中间体。由于PpIX在大脑中天然存在的很少，因此Wilson首先用ALA洗涤靶标区域，ALA会导致癌细胞代谢增加，从而导致PpIX水平升高。这样组织就能表达其荧光基团，发射出比自发荧光更长波长的光。

但是PpIX荧光很暗，光线的强度也会由于组织的吸收和散射而减少，并且从光源到组织，组织到成像系统的距离等也都会影响最终的效果，因此Wilson在对组织反射的激发光和散射的更长波长的光都进行了检测，记录下了比率之后，又用不同的激发波长进行了第二次的检测，这样就得到了两个数据，他表示，“这种交比技术（double ratio）很好的弥补了自荧光，组织光反射，以及几何距离对成像的影响。”

 

这里用到的ALA，即5-aminolevulinic acid，来自于DUSA Pharmaceuticals，这是一家致力于皮肤疾病治疗药物研发的公司，其最著名的药品是治疗痤疮粉刺的Levulan Kerasticks。用于实验中的是kerasticks，包含有354mg的ALA，价格是706.38美元。

在体内荧光成像过程中，如果确实遇到了无法逾越的问题，也可以考虑转向其它方法，比如更换光源，GE公司基于时域技术的eXplore Optix成像系统，利用的就是脉冲激光二极管发送窄光谱的激光短脉，这种方法突破了传统成像方法对光学信号强度的依赖，能提供对荧光团强度、浓度和三维定位的精确测量，并且由于eXplore Optix具有纳秒级的时间分辨率，所以研究人员可进行活体荧光寿命测量，从而辨别具有类似光谱图的荧光团。除此之外，由于eXplore Optix是集成的多模式平台，因此可以对多个生物学靶标进行分析监控。

不过由于激光的直径仅为1mm，影响了扫描的速度，因此只适用于动物局部成像，要完整的进行动物整体成像，可以选择今年Kodak的多光谱荧光活体成像系统。这个系统（In-Vivo Multispectral Imaging Systems FX）最大的特点就是可以同时实现荧光、生物学发光、X光和同位素成像，大大拓展了体内成像的能力。由于不在荧光成像范围内，这里就不馕述了，具体可见2008年度生命科学十大创新产品评选。

 

Tips：

1.仔细选择靶标

在对成像过程进行优化之前，需要再次确定是否针对特定的生物学问题选对了靶标，比如说，进行体内乳腺癌成像，比较合适的靶标包括肿瘤前缘区的基质金属蛋白酶（matrix-metalloproteinases），增殖期细胞核蛋白Ki-67，雌激素关联的cathepsin D，或者其它一些分子标志物，每个不同的靶标会得到不同的成像结果。

2.寻找合适的荧光基团

如果使用的是传统的荧光标记，那么很容易就能确定其激发和发射波长是否与你的仪器相匹配，而Quantum dots在这些参数方面要求更严格，由于不同组成，包被和大小的QDs具有特定的吸收和发射光谱，因此在进行设计的时候就要注意与后期的实验一致。

3.收集对照信息

体内环境，包括pH值，蛋白环境，以及交联标记的结合状态，都会改变荧光标记的光谱特征和衰减特征，因此针对这些变化需要仔细的设计对照实验，利用这些对照尽可能多收集附加的这些生物信息，比如说荧光信号的衰减方式对于靶标分子的适合性状态具有指导意义。

4.收集几个波长的发射光

当我们看到数据图时，第一个要问的问题就是：“误差范围（error bars）是什么？”但是一般来说，我们都相信眼见为实，因此看到图像的时候也许不会想到误差。要记住眼睛有时也会欺骗我们——很多种可能都会产生看起来像是绿色的信号，如何避免这种情况呢？比如可以利用光学滤波（optical filtering）收集几个不同波长的数据，Cambridge Research & Instrumentation (CRI)公司就构建了一种与不同荧光来源信号相匹配的发射光光谱，这样就能增加每一个峰值信号的可信度。

5.寻找实验中的灵感

近期威斯康星大学麦迪逊分校的研究人员发现利用闪烁的标记能帮助更容易在活细胞中定位细胞结构。这种简单有效的方法帮助区分了靶标和背景信号，发现者感叹如此简单，又不增加成本的方法其实早就应该想到了，这提示我们研究人员在实验中多思考，也许就能找到实验技术的突破点了。

（生物通：张迪）