[心得点评]如何提高转染实验成功率

一般情况下哺乳动物细胞摄取并表达外源基因的效率很低，科学家们因此开发了转染技术来克服这个障碍。然而并不是每次转染都能成功，转染成功率可以说已经成为了限制性的瓶颈问题，如何提高转染成功率？如何抓住转染成功的关键？看看罗氏的专家怎么说？

---

选择合适的试剂并正确使用是转染成功的基础 

---

引言

在通常情况下，哺乳细胞摄取并表达外源基因的效率很低，这主要是由于真核细胞的脂质双层膜是阻止带电荷分子进入细胞的巨大障碍。目前人们已开发了数种转染技术来克服这个障碍。有了这些技术后，采用DNA或RNA转染的方法来研究培养细胞中的基因表达就成为了生物学研究中的常规手段。

简而言之，转染是指将DNA、RNA、蛋白质或者其他大分子输送进入真核细胞内。使用转染技术的目的包括对基因调节以及蛋白质的表达和功能等进行研究。

现已建立并完善了数种不同的技术将各种分子，尤其是核酸输送进入真核细胞内。这些转染技术是基于三种不同的策略来实现的。（详情请见www.roche-applied-science.com／transfection）

没有一种转染试剂是可以普遍适用的 

并不是所有的转染技术都能适用于所有类型的细胞或实验。采用不同的转染技术在所能获得的基因表达水平方面差异很大。

此外，没有一种单一的技术能够适合于转染实验所用不同细胞体系的多样性。每种转染技术都会有其自身的优点和缺点，而取决因素则包括，例如，需要转染的细胞类型（对于不同的细胞系尤其如此），需要被转染的分子（DNA、RNA、寡核苷酸、蛋白质），或者甚至是对转染应用高通量的要求等都会有所影响。但无论在何种情况下，转染成功都取决于转染效率、低细胞毒性、以及重现性这几个要素。为确保转染的高效性，您需要选择一种可靠的转染技术及转染试剂，使之在您的细胞培养条件下能够发挥最佳效果。

为了选择最符合您需要的转染试剂，您需要检索有关您所需的特定细胞类型或使用方式的现有文献资料，考察不同试剂的特点（可在网上获取；请参见www.roche-applied-science.com／transfection） 并且，如果可能的话，还要采用有关试剂所推荐的方案对几种不同的试剂进行测试。

针对特定使用方式的注意点

细胞生理

为了研究细胞生理，或用细胞进行目标验证，要注意确保所使用的转染过程本身不会改变研究目标的效应途径，或者如果有所改变的话，其改变程度也应尽量减小。如果您所用的转染试剂对细胞有害，那么就很难区分所产生的效应到底是出自转染过程本身还是被转染的特定基因。正因为这个原因，一定要同时转染空载体或含有无关基因的载体作为空白对照。仅有如此您才能对目标基因所产生的效应做出评价。

在进行转染时，您总是希望能获得最佳的转染效率，并且尽量减小相差显微镜下可见的细胞形态学变化。在使用我们的两种转染试剂FuGENE® 6和FuGENE® HD对细胞进行的转染研究中，我们采用了微阵列分析方法，来确定基因表达上调或者下降的数量。结果发现我们的这些试剂和其他同类试剂（见参考文献）相比较，对试验细胞所产生的非目标效应要少许多。

使用瞬时转染来生产蛋白

以往为了获得蛋白质的高表达产量，您必须先转染细胞，然后挑选一个稳定的转染细胞系进行蛋白的扩增和富集。而挑选这样一个细胞系往往需要花费数周甚至数月的时间，这既可能是由于试剂的细胞毒性也可能是由于转染的低效率。如果是因为转染试剂具有细胞毒性，那么只有少数细胞能够存活，从而导致蛋白质的产量很低。而如果是因为转染成功的细胞太少，那么那些未转染的细胞其生长速度大大超过转染成功的细胞，其结果同样也只能产生少量的目标蛋白。

现在，为了获得蛋白质高表达，您有了一个更好的选择，即使用一种温和的可以转染大多数细胞的转染试剂。使用FuGENE® HD转染试剂，您可以在转染后3-7天获得高产量的蛋白质，因为这种转染试剂几乎没有细胞毒性，可以转染大多数的细胞，并且每种能被转染的细胞都能获得高产量。

但仍有一些蛋白能获得比其他蛋白更高的产量。因此，现将一些影响到蛋白表达高水平的关键因素分列如下：

细胞系（有些类型的细胞比其他细胞产量高） 
质粒骨架（例如：增强子，启动子，转录调控元件） 
目标蛋白（有些蛋白很难获得高表达量）
目标蛋白的cDNA序列（例如：密码子的优化）
培养条件（营养物，代谢废物，转染抑制物）

当这些因素都得到优化，并加入合适配比和数量的转染复合物（转染试剂－质粒）后，就可获得至少达到平均表达水平的稳定表达克隆。

瞬时转染和稳定转染的比较

制备一种稳定细胞系的第一步是选择一种同时含有选择性标记物和目标基因的载体。选择性标记物通常是可以产生一种蛋白质或者酶来帮助细胞在某些毒性物质存在下存活的基因。

一旦选好了质粒载体，无论短暂或者稳定表达都采用一样的转染方法。被转染的细胞至少要在标准培养基中培养一夜，直到加入选择性试剂。这样就使细胞有时间表达足量的蛋白使之能够耐受选择性试剂的作用。细胞于是在加有选择性试剂的培养基中生长。那些未成功转染质粒的细胞即被杀死。而只有那些成功转染的细胞能够生长。有的时候，还可以将选择性试剂持续加入到培养基中，以维持对细胞的选择压力。


目前罗氏应用科学部所提供的转染试剂

罗氏应用科学部为多种转染方法提供不同的试剂。下面对这些试剂作一概述。

多组分试剂

这是一种创新的多组分试剂，同时具有高转染效率和低细胞毒性，因此无需再进一步优化。罗氏应用科学部可提供的多组分转染试剂有若干种：


FuGENE® 6 转染试剂（目录编号. 11814443001，11815091001, 11988387001，和11988484001）

FuGENE® 6 转染试剂是一种优化的含有脂类和其他专利化合物的混合物。这种试剂同时具有高转染效率和极低的细胞毒性。同基于阳离子脂质体的转染试剂相比，它首次使用就可使转染成功（并不需要事先优化转染条件）。采用这种试剂已经成功地转染了超过700多种细胞，其中还包括很多原代细胞。

因为它很容易使用，同时又很温和，所以适用于新近 经胰蛋白酶消化所得的细胞，非常适合于一系列的高通量筛选。

FuGENE® H D 转染试剂（目录编号 04709691001，04709705001, 04709713001）

FuGENE® HD 转染试剂是一种“新生代”转染试剂，不含任何动物或人体来源的成分，在室温下稳定，并经过无菌过滤处理（0.1µm）。FuGENE® HD 转染试剂是一种多用途试剂，适合不同的应用场合。其优点如下：

它有一套便利的优化方案，使之能够转染的真核细胞范围很广，包括从动物到昆虫的多种细胞类型，而细胞毒性却非常小。
对许多经其他试剂转染效果不佳的细胞系而言，使用这种试剂的效率却极好，比如MCF-7、RAW 264.7、PC-3、HeLa、MA-10、HepG2、SH-SY5Y、A7r5、STO、SCC-61、STSAR-90、SQ20B、T98G、A375、A549和干细胞等。

它尤其对于长时间的蛋白表达实验有效，这是因为它能转染蛋白表达常用的许多适于贴壁或悬浮的细胞系（如，CHO-K1，HEK 293，和昆虫细胞等）。

它使细胞无论在含有血清的培养基还是在不含血清的培养基中生长，都能够表达高水平的重组蛋白。

FuGENE® H D 转染试剂甚至可使细胞在高浓度的血清（最高达100％）中表达高水平的蛋白。因此，在这类情况下就可以选择FuGENE® H D 转染试剂进行研究。

X-tremeGENE siRNA 转染试剂（目录编号 04476093001，04476115001）

RNA干扰（RNAi）技术是抑制某种特定基因表达的一种有效方法。RNAi 实验所需的转染试剂应当是针对向哺乳动物输送siRNA所特别优化的。这种试剂就是X-tremeGENE siRNA 转染试剂，它能与siRNA形成复合物并将其有效地输送进入真核细胞。该试剂能有效转染很多中常用地细胞系，包括HeLa，NIH 3T3，HEK-293，CHO-K1，COS-7，和若干种“转染困难户”细胞系。在以共转染为基础的RNAi 实验中，X-tremeGENE siRNA 转染试剂既可以支持蛋白高表达又能进行有效的基因敲除。

注：该试剂具有低细胞毒性。它还可以在血清存在或不存在的情况下都发挥极佳的作用；在转染前和加入转染复合物之后它都不需要更换培养基。 

阳离子脂质体试剂

如果将一种阳离子脂类和一种中性脂类混和，就会形成多层脂质体囊，由于其阳离子分子具有高度正电性的氨基，因此该脂质体囊所携带静电荷为正。核酸可吸附到这些囊泡上并很可能通过脂质体与浆膜间形成的内吞囊泡而得以进入细胞内部。经仔细优化转染条件后，通过脂质体介导的转染技术要比早期使用的转染方法更为有效也更加简便。罗氏应用科学部可提供三种脂质体类试剂用于转染DNA、RNA和寡核苷酸：


DOTAP 脂质体转染试剂（目录编号. 11202375001，11811177001）
DOTAP是一种单阳离子试剂。

DOSPE R 脂质体转染试剂（目录编号. 11811169001，11781995001）
DOSPER是一种聚阳离子试剂。

X-tremeGENE Q2 转染试剂（目录编号. 03045595001，03036421001）
X-tremeGENE Q2 转染试剂经设计并优化用于在K-562和Jurkat细胞中的转染和蛋白高水平表达。
注：该专利试剂以干态脂质膜的形式供应。

若需查阅应用罗氏应用科学部研制的转染试剂所成功转染的细胞类型清单，请参见罗氏公司网站的转染数据库：
www.roche-applied-science.com／transfection

下篇：

[罗氏推荐]转染实验成功的关键