microRNA模拟物和阻遏物常见问题解答:Dharmacon® miRIDIANTM microRNA模拟物&阻遏物手册之三[心得点评]

【字体: 时间:2008年06月24日 来源:赛默飞世尔

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  这些模拟物和阻遏物的活性是否经过成功测试?购买后可以不用检测而直接使用吗?
如何才能将miRIDIAN microRNA模拟物和阻遏物有效转染入细胞?
什么样的缓冲液最适合用来水化miRIDIAN microRNA模拟物和阻遏物?
miRIDIAN microRNA阻遏物的抑制效果可持续多久?
miRIDIAN microRNA模拟物和阻遏物是否可以用于体内实验研究(如通过小鼠尾静脉注射)?

Dharmacon® miRIDIANTM microRNA模拟物&阻遏物手册之

microRNA模拟物和阻遏物常见问题解答

    这里列举了研究人员使用该产品过程中常遇到的问题及其解决方案,希望对大家的研究有所帮助。

  1. 这些模拟物和阻遏物的活性是否经过成功测试?购买后可以不用检测而直接使用吗?
        运用报告基因系统在数种细胞系中测试了miRIDIAN microRNA模拟物和阻遏物对特定miRNA活性的影响,我们在报告基因系统转染较低的纳摩浓度范围(50nM甚至更低)内进行了测试。事实上,最佳的浓度应该根据不同的细胞类型和不同的模拟物和阻遏物进行实验测试,一般设置浓度梯度和时间曲线进行测试。如要检测某种细胞系的某种miRNA,我们建议检测的时间点为转染后24,48和72小时,转染梯度为100nM,50nM,10nM,2nM,0.4nM。由于miRNAs在不同的细胞类型可能高表达、低表达甚至不表达,也可能和其它的miRNAs协同发挥作用,因此实验中应该根据内源性miRNAs的表达水平决定模拟物和阻遏物的最佳工作浓度范围。
     

  2. 什么样的缓冲液最适合用来水化miRIDIAN microRNA模拟物和阻遏物?
        miRIDIAN microRNA模拟物和阻遏物以及阴性对照产品的操作环境应该和RNA的操作保持一致,也就是说,恰当的重悬和保存这些试剂可以选择使用1×siRNA缓冲液。另外,其它具有中性pH范围的无RNA酶水也是不错的选择。
     

  3. 如何才能将miRIDIAN microRNA模拟物和阻遏物有效转染入细胞?
        miRIDIAN microRNA模拟物和阻遏物可以运用常规的脂质体或者电转的方法进行转染。不同的细胞系或者细胞类型会影响最佳转染方法和转染条件,此点与转染其它的小分子核酸(单链核苷酸或者双链siRNA)非常相似。

        Dharmacon专为小分子RNA转染所设计的DharmaFECT转染试剂可用于转染模拟物和阻遏物(内附特定细胞系的转染说明书)。实验中建议设置浓度梯度和检测时间曲线,建议浓度梯度可设置为100nM,50nM,10nM,2nM,0.4nM,而检测时间点可设置为转染后24,48和72小时。不管用何种方法,最佳的转染浓度和检测时间点应当根据不同细胞类型和不同的模拟物和阻遏物以及检测方法而确定。
     

  4. miRIDIAN microRNA阻遏物的抑制效果可持续多久?
        阻遏物效果的持续时间更多地依赖于特定细胞系中成熟miRNA的表达情况。一般来说,转染细胞后阻遏物效应可持续至少48小时,通过化学修饰后的阻遏物其抑制效应可持续至少96小时。我们建议运用不同的时间曲线进行实验来检测其抑制效果的持续性。
     

  5. miRIDIAN microRNA模拟物和阻遏物是否可以用于体内实验研究(如通过小鼠尾静脉注射)?
    下面是两篇报道了体内使用miRNA阻遏物产品的文献,可供研究者参考:
    1) Krützfeldt, JN, et al. Silencing of microRNAs in vivo with 'antagomirs'. Nature. 2005, 438(7068):685-9.
    2) Christine Esau, et al. miR-122 regulation of lipid metabolism revealed by in vivo antisense targeting. Cell Metab. 2006, 3 (2):87-98.

     

  6. 有广泛地报道使用miRIDIAN microRNA模拟物和阻遏物的文献吗?
    请参考下面“参考文献推荐”部分,从文献中可以了解到使用模拟物/阻遏物的浓度,转染的细胞类型以及在本研究中的意义等信息。


microRNA模拟物和阻遏物相关参考文献推荐
参考文献推荐:
1. Kato M, Zhang J, Wang M, et al. MicroRNA-192 in diabetic kidney glomeruli and its function in TGF-beta-induced collagen expression via inhibition of E-box repressors. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007, 27; 104(9):3432-7.
2. Plaisance V, Abderrahmani A, Perret-Menoud V, et al. MicroRNA-9 controls the expression of Granuphilin/Slp4 and the secretory response of insulin-producing cells. J Biol Chem. 2006, 15; 281(37):26932-42.
3. Karginov FV, Conaco C, Xuan Z, et al. A biochemical approach to identifying microRNA targets. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007, 4; 104(49):19291-6.
4. Volinia S, Calin GA, Liu CG, et al. A microRNA expression signature of human solid tumors defines cancer gene targets. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006, 14;103(7):2257-61.
5. Raveche ES, Salerno E, Scaglione BJ, et al. Abnormal microRNA-16 locus with synteny to human 13q14 linked to CLL in NZB mice. Blood. 2007, 15; 109(12):5079-86.
6. Lu S, Cullen BR. Adenovirus VA1 noncoding RNA can inhibit small interfering RNA and MicroRNA biogenesis. J Virol. 2004 Dec;78(23):12868-76.
7. Elmén J, Lindow M, Silahtaroglu A, et al. Antagonism of microRNA-122 in mice by systemically administered LNA-antimiR leads to up-regulation of a large set of predicted target mRNAs in the liver. Nucleic Acids Res. 2007 Dec 23 [Epub ahead of print]
8. Lee YS, Kim HK, Chung S, et al. Depletion of human micro-RNA miR-125b reveals that it is critical for the proliferation of differentiated cells but not for the down-regulation of putative targets during differentiation. J Biol Chem. 2005, 29; 280(17):16635-41.
9. Jiang F, Ye X, Liu X, et al. Dicer-1 and R3D1-L catalyze microRNA maturation in Drosophila. Genes Dev. 2005, 15; 19(14):1674-9.
10. Suárez Y, Fernández-Hernando C, Pober JS, et al. Dicer dependent microRNAs regulate gene expression and functions in human endothelial cells. Circ Res. 2007, 27;100(8):1164-73.
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14. Kim HK, Lee YS, Sivaprasad U, et al. Muscle-specific microRNA miR-206 promotes muscle differentiation. J Cell Biol. 2006, 28; 174(5):677-87.
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16. Farh KK, Grimson A, Jan C, et al. The widespread impact of mammalian MicroRNAs on mRNA repression and evolution. Science. 2005, 16;310(5755):1817-21.
17. Linsley PS, Schelter J, Burchard J, et al. Transcripts targeted by the microRNA-16 family cooperatively regulate cell cycle progression. Mol Cell Biol. 2007, 27(6):2240-52.
18. Chapman EJ, Prokhnevsky AI, Gopinath K, et al. Viral RNA silencing suppressors inhibit the microRNA pathway at an intermediate step. Genes Dev. 2004, 15; 18(10):1179-86.

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