整合全新完美设计理念的shRNA技术:Dharmacom SMARTvector shRNA Lentiviral Particles[新品推荐]

【字体：大中小】 时间：2008年06月26日 来源：赛默飞世尔

编辑推荐：

　　持久的基因沉默效果
独特的shRNA设计参数
高滴度、高纯度、即开即用型病毒颗粒
可将有沉默功能序列导入几乎所有的细胞系，包括那些对常规转染有抵抗性的细胞如干细胞，原代细胞以及神经元细胞等，从而达到持久的基因沉默。

概述：
Thermo Scientific Dharmacon SMARTvector shRNA 慢病毒表达平台有两大功能创新：第一，可提高由DNA介导的RNA干扰的功能性和特异性；第二，可降低由于自己制备的慢病毒的滴度低而引发的毒性。应用该平台独特的SMARTvecto表达技术，研究者可将有沉默功能的序列导入几乎所有的细胞系，包括那些对常规转染有抵抗性的细胞如干细胞，原代细胞以及神经元细胞等，从而达到持久的基因沉默。

特点：

独特的MicroRNA表达框架设计：有助于高效地处理加工shRNA
Dharmacon SMARTvector shRNA设计软件的重大突破：
* 可最大限度地筛选出沉默效应最强的序列
* 基于microRNA“seed-region”区域的生物信息滤过技术，增强活性链与RISC结合偏好性，大大增强基因沉默的特异性。
即开即用型慢病毒颗粒，操作方便，功能强大：
* 广泛导向性的病毒载体系统保证了对几乎所有细胞的导入性；
* turboGFP标签可方便通过荧光观测评价转染效率；
* 嘌呤霉素筛选标记使获得稳定基因沉默细胞株变得简单快捷。
专利生产技术和工艺流程保证了高滴度、高纯度病毒颗粒的获取

工作原理图示：

Figure 1．The SMARTvector platform utilizes lentiviral vectors to deliver and constitutively express gene silencing reagents capable of entering the RNAi pathway

慢病毒载体颗粒感染细胞且将其RNA基因组导入细胞质；
病毒载体基因组在细胞质进行反转录（RNA反转录为DNA）；
病毒载体DNA基因组转运进入宿主细胞核；
病毒载体DNA基因组稳定地整合在宿主细胞基因组上；
沉默组件持续表达并加工生成具有沉默功能的shRNA。

理性设计确保可靠、稳定的基因沉默
Dharmacon的SMARTvector shRNA慢病毒表达框架整合了确保细胞成功感染和对靶基因高效沉默至关重要的设计元素，这些元素均经过系统的实验评估，以实验评估结果为基础打造出目前最强大的基因沉默平台。

高效的microRNA表达框架——shRNA表达研究的利器

通过对大量的人类microRNA表达框架进行测试，发现其所表达加工的shRNA对靶基因沉默效率不尽相同，不同的MicroRNA表达框架呈现出截然不同的功能性。Dharmacon根据不同的microRNA表达框架的实验评估最终选择了可以高效加工shRNA的microRNA表达框架，并确保这些表达框架加工的shRNA可以高效特异性地沉默靶基因。在此过程中，Dharmacon发现：

 不是所有的microRNA表达框架都能够高效加工shRNA
 某些microRNA表达框架也可以加工出具有活性的”passenger”链，从而降低基因沉默特异性


Figure 4. Five microRNA scaffolds (a-e) were identifi ed as effi ciently processed, and silenced their respective targets by > 75%. These highly functional microRNAs represent a signifi cant improvement over currently available microRNA-based scaffolds used in other RNAi expression platforms.	Figure 5. The functionality of the passenger (star) strand for six human microRNA expression scaffolds was assessed. Candidate microRNA scaffolds were selected based on high levels of knockdown by the mature strand and minimal activity of the passenger (star) strand.

Dharmacon选择兼具功能强大的成熟链活性和最小“passenger”链功能的MicroRNA表达框架来构建SMARTvector shRNA的表达载体。图5显示6个人源的microRNA表达组件的“passenger”链功能的比较分析结果，只有那些由成熟链引起的具有很高水平的沉默功能同时有最小的“passenger”链功能的microRNA组件才可以作为候选表达组件。

shRNA的理性设计策略----靶基因高效沉默的保证

到目前为止，对于由DNA介导的RNA干扰的设计主要依赖于如何将siRNA序列转化为有沉默功能的针对靶基因的shRNA。因为实验证明许多沉默功能很好的siRNA以shRNA的表达方式作用于靶基因时并不能起到很好的沉默效果，另外并不是所有的microRNA组件都能很好的导入外源序列。鉴于此，Dharmacon科学家开发出了即能提高shRNA表达，又能提高沉默效率的设计软件。图6显示了SMARTvector shRNA理性设计软件的功能表现。

Dharmacon研发出第一个shRNA设计软件，用来设计和筛选沉默功能强大，且具超强特异性的沉默组件。该设计软件综合考虑了如下因素来挑选和设计与专利的MicroRNA表达组件相容的针对靶基因的序列：

双链偏好性的热力学特性
特定局部和全长中的GC含量
影响后续加工的二级结构
点依赖性的核苷选择参数
“seed-region”区互补序列的过滤。

shRNA慢病毒独特的表达框架，保证了其高效导入众多细胞
Dharmacon 的SMARTvector shRNA慢病毒颗粒利用了有助于细胞导入的VSVg外壳蛋白，保证了对常规难转染细胞的高导入性，例如干细胞，未分化细胞，原代细胞以及神经元细胞等。Turbo GFP绿色荧光蛋白的表达有助于在荧光显微镜下监测感染效率。图7显示了Turbo GFP绿色荧光蛋白在4个不同的细胞系里感染72小时后的表达情况。

不用抗性筛选即可持久沉默靶基因
如图8所示：在嘌呤霉素选择压力下，用 SMARTvector GAPD阳性对照转染SH-SY5Y细胞，图8显示了GAPD基因敲除后的荧光显微镜成像结果。

运用嘌呤霉素筛选可获得长期稳定沉默的细胞株
Dharmacon SMARTvector shRNA慢病毒颗粒感染后的细胞可通过嘌呤霉素抗性筛选获得持久稳定的靶基因沉默细胞系（或者单个的细胞克隆）。图9显示用Dharmacon SMARTvector shRNA慢病毒颗粒感染后得到的稳定基因沉默。

SMARTvector shRNA----即开即用型的成熟病毒颗粒

研究者在实验室自己构建并生产用于RNAi实验的慢病毒颗粒需要花费很大的成本，包括时间、劳动力和金钱。Dharmacon的SMARTvector shRNA产品提供给客户为高质量、高滴度包装好的即开即用型的病毒颗粒。省却客户自己在构建shRNA病毒颗粒过程中需要设计功能性shRNA序列、克隆到特定的表达框架和生产足够高质量的病毒颗粒等诸多麻烦。Dharmacon通过与其战略伙伴Lentigen公司合作，提供的SMARTvector shRNA干扰产品最终为经过纯化浓缩过的滴度大于108 TU/mL的成熟病毒颗粒。

高质量、高滴度的病毒颗粒极大地减少了细胞毒性，也极大地降低了脱靶效应。

订货信息：

Catalog Number	Unit Size	Price(RMB)
Individual Construct
SH-#####-01-10	100 uL, 10⁸TU/mL minimum titer	26340
SH-#####-02-10	100 uL, 10⁸ TU/mL minimum titer	26340
SH-#####-03-10	100 uL, 10⁸ TU/mL minimum titer	26340
Set of 3 Constructs
SK-#####-00-10	100 uL, 10⁸ TU/mL minimum titer	56340
SK-#####-00-25	25 uL, 10⁸ TU/mL minimum titer	23940
SMARTvector Human GAPD Control Particles
S-001000-01	50uL, 10⁸ TU/mL minimum titer	7800
SMARTvector Empty Vector Control Particles
S-004000-01	50uL, 10⁸ TU/mL minimum titer	7800
SMARTvector Non-targeting Control Particles
S-005000-01	50uL, 10⁸ TU/mL minimum titer	7800
SMARTvector Firefly Luciferase Control Particles
S-006000-01		7800