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改善RNA提取质量的十大要点[心得点评]

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2008年08月20日 来源:生物通

摘要:

  RNAse的无处不在导致了RNA的脆弱敏感。要改善RNA提取的质量,专注RNA的Ambion公司专家为你介绍在RNA纯化过程中要特别注意的10个问题。另外还有Ambion荣誉产品超级促销信息!

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ABI供稿,生物通翻译

  1. 在收获组织及细胞死亡之后,应立即灭活内源的RNA酶,以防止RNA降解。
        以下3个方法均可有效使内源RNA酶失活:

    1)用含离液(如胍盐)的细胞裂解液收获样品,并立即匀浆。
    2)用液氮瞬间冻结样品。值得特别注意的是:组织块必须保证足够小,在浸入液氮的瞬间就能冻结,以确保瞬间令RNA酶失活
    3)立即将样品置于RNAlater™ Tissue Collection: RNA Stabilization Solution中。它是一种水相、无毒的收集试剂,能立即稳定并保护完整、未冻结的组织和细胞样品中的RNA。关键要点是组织样品切片一定要够薄(<0.5 cm),这样RNAlater才能在RNase破坏RNA之前迅速渗入组织块中。

     

  2. 使用正确的细胞或组织储存条件
        在样品用液氮瞬间冻结之后,应该储存在-80°C,千万不能解冻。即使是置于含有胍盐的裂解液中作匀浆前的短暂解冻,也会导致RNA的降解和损失。瞬间冻结的组织应该首先在超低温条件下先研磨成粉,然后置于裂解液中进行匀浆。

        RNAlater使样品储存更为便利。储存在RNAlater中的细胞或组织可在室温下稳定保存长达1个星期,在4°C可稳定保存长达1个月,或永久保存在-20°C。有关RNAlater的更多信息请参考 www.ambion.com/techlib/resources/RNAlater.
     

  3. 彻底匀浆样品
        细胞或组织的彻底匀浆对RNA提取来说,是一个很关键的步骤,它能够防止RNA的损失和降解。匀浆的方法应根据细胞或组织的类型来选择。大部分培养的细胞可以置于细胞裂解液中,通过简单的涡旋震荡来匀浆;而动物组织、植物组织、酵母和细菌则常常需要更加剧烈的方法。比如说细菌的细胞壁,就需要酶消化来实现彻底的细胞裂解和RNA的最大回收。有关各种不同的样本类型,哪些方法是最适合的匀浆方法,请参考 www.ambion.com/techlib/tb/tb_183.html.
     

  4. 在RNA提取之前预处理样品裂解液
        对于某些样品来说,在匀浆之后,RNA提取之前,还需要一些额外的处理步骤。对于脂肪含量高的组织,像脑组织和脂肪组织得到的裂解液,就需要通过氯仿抽提来去除脂类,从而提高RNA产量。许多植物组织中富含多酚和多糖,会降低RNA的质量和产量,用Plant RNA Isolation Aid 预处理裂解液可去除这些难以处理的成分。
     

  5. 选择最好的RNA分离方法
        现有众多的RNA分离方法也许令人难以取舍。目前最简单也是最安全的方法是柱式分离,如RNAqueous™ RNAqueous-4PCR Kit。因为操作简单,所以这些步骤特别适用于同时处理多个样品。如果是处理复杂的组织,如富含核酸酶(胰腺)或脂肪(脑和脂肪组织)的样品,就推荐使用更加严格的、基于酚处理的RNA分离方法,如ToTALLY RNA™。更多的信息请参考 www.ambion.com/techlib/tn/83/8311.html 。更多方法选择,请参考 http://www.ambion.com/techlib/trees/RNA/index.html
     

  6. DNase处理
        如果提取的RNA将用于RT-PCR,我们推荐用DNase处理纯化的RNA样品以去除残留的DNA污染。当样品来源于富含DNA的组织,如脾脏时,DNase处理也是一个好办法。AmbionRNAqueous-4PCR Kit的实验流程中包含了DNase处理的步骤,并提供了必需的试剂(DNA酶I)。DNA-free™ DNase treatment & Removal Reagents 则可用于去除用各种方法制备的RNA样品中的DNA污染。这两个产品都提供了高质量的DNase I,优化的反应缓冲液,和DNA酶消化处理后简单快速去除DNase的方法,无需使用有机溶剂和热处理。
     

  7. 减少环境RNase的暴露
        为了得到完整的、高品质RNA,在整个RNA制备过程中,当RNA离开强蛋白变性剂(如离液裂解液或酚)的保护时,避免引入新的RNase污染就非常关键。由于RNase几乎是无所不在,所以必须确保与纯化的RNA接触的每一样东西都是无RNase污染的。所有的表面,包括移液器、工作台、玻璃器皿和制胶设备,都必须用表面去污净化溶液如RNaseZap™ 或RNaseZap Wipes 来处理过。必须保证一直使用无RNase的枪头、试管和溶液,手套也应经常更换。
     

  8. 正确的沉淀
        纯化得到的RNA可能需要通过沉淀来浓缩,以满足一些下游应用的需要。醋酸铵(NH4OAc) 沉淀(加0.1体积的5 M 醋酸铵、2-2.5体积的无水乙醇,-20°C放置25分钟以上)可以很好地回收RNA。如果需要定量回收低浓度的RNAng/ml),可以采用共沉淀(如糖原glycogen,、酵母yeast RNA或linear acrylamide的方法。当RNA用于RT-PCR分析时,线性的丙烯酰胺和DNase处理的糖原都可以作为理想的共沉淀剂,因为它们都不含DNA污染。酵母RNA和未处理的糖原会给样品带来核酸污染,有可能影响RT-PCR的结果。沉淀后,注意避免RNA沉淀过分干燥,因为这可能导致很难重新溶解。
     

  9. 重悬
        许多RNA提取步骤的最后一步是溶解纯化的RNA沉淀。理想的重悬溶液应该满足3点要求:无RNase污染、较低的pH值(pH 6-7)、含有螯合剂,以保护RNA不受带入的RNase的降解。(THE RNA Storage Solution能满足以上所有标准。)为了帮助溶解,RNA沉淀可置于重悬溶液中在65°C孵育5分钟,并不时轻摇以帮助溶解。
     

  10. 储存
        如果只是短期储存,重悬的RNA应放置于-20°C;如果是长期储存的话,就应该放置于-80°C。尽管重悬于水或缓冲液中的RNA也可以储存在-80°C,但保存于醋酸铵/乙醇溶液中的RNA沉淀则更加稳定。我们推荐将RNA溶液分装在几支管中。这会避免反复冻融损伤RNA,并预防偶然的RNase污染。

ABI供稿,生物通翻译 
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AM1835 MagMAX™-96 AI/ND Viral RNA Isolation Kit 4 x 96 prep  禽流感与新城病毒抽提试剂盒,适合从各种样本中抽提低浓度AI/ND病毒,美国国家畜牧服务实验室NVSL推荐,适合大量样本同时抽提,可配合高通量移液系统使用  ¥16,088
mRNA抽提与纯化      
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