专家指南:miRNA分析中的qRT-PCR疑难解答(上)[心得点评]

【字体: 时间:2008年09月17日 来源:生物通

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  在miRNA分析中,实时定量PCR是一个有力的工具。不过对于具体的问题,例如怎么设计引物,如何确定Ct值,如何区分前体和成熟的miRNA,你可能还是有一堆问号。那就进来看看吧,专家为你答疑解惑。

实践出真知。我们的实验中往往会遇到一些很细节的问题,但在普通的教科书上又找不到现成的答案。怎么办?寻找身边的实验达人。可是在miRNA这个相对较新的领域,达人还不太多。生物通就帮大家找了一班实验达人,就miRNA分析中的qRT-PCR检测的6个热门问题,谈谈自己的经验。希望大家可以从中受到一点启发。

Q1:如何为miRNA设计引物?利用茎环结构还是引物延伸?
Q2:如何确定Ct值?理想的Ct值是多少?
Q3:如何检测miRNA?使用SYBR green吗?
Q4:你如何确定检测效率?怎样称之为好的效率?
Q5:如何区分前体和成熟的miRNA?
Q6:还需要其他的定量分析来进行补充吗?

Q1:如何为miRNA设计引物?利用茎环结构还是引物延伸?

John Rasko & Stephane Flamant 美国centenary大学的基因和干细胞治疗计划
我们的方法是基于经典的小分子RNA克隆。从总RNA入手,在microRNA的3’端加上一个接头。然后利用接头特异的引物来进行反转录(引物延伸法)。接着还是利用同样的引物,连同5’microRNA特异的引物,来进行定量PCR反应。由于microRNA的确很小,引物的选择余地也不大。我们通常设计的引物覆盖最初15-17个核苷酸,留下最后6个核苷酸用于测序验证。

Thomas Schmittgen 俄亥俄州立大学副教授
我们只利用ABI的TagMan assay(茎环结构)来检测成熟的microRNA。这些assays是预先设计并验证过的。

Frank Slack, Phong Trang, & Joanna Weidhaas 耶鲁大学医学院
我们应用的是TaqMan assays。由于micoRNA很短,采取茎环结构的引物会更好。

M.azim Surani & Fuchou Tang 剑桥大学Gurdon Institute
我们也是应用茎环结构的引物来定量microRNA。对于每一个microRNA,我们设计了三条引物:一条反向引物用于反转录,一条正向引物,还有一条通用的反向引物,同时用于pre-PCR扩增步骤和实时定量PCR步骤。特异的反向引物约42-44个核苷酸,其5’端的36个核苷酸序列是固定的,形成一个8核苷酸环和20核苷酸茎的结构,其3’端的6-8个核苷酸就与microRNA互补。正向引物长约25-32个核苷酸,在3’端有11-18个核苷酸与相应的microRNA互补,而剩余14个核苷酸的Tm值高于65摄氏度。通用的反向引物为23nt,其中18个核苷酸对应特异反向引物的茎环结构部分,而5’端的5个核苷酸的Tm值高于65摄氏度。

Wei Yan 美国内华达州大学医学院
我们的microRNA PCR方法是将小分子RNA的cDNA(srcDNA)作为模板。srcDNA由microRNA聚腺苷酸后,用RTQ引物反转录产生。RTQ引物在5’端包含一个100bp的接头序列,然后是25 oligo dT,以及两个简并核苷酸V(A、G或C)和N(A、G、C和T)。特定microRNA产生的srcDNA水平可由PCR进行分析,用microRNA特定的引物作为正向引物,对应srcDNA3’端接头序列的通用引物作为反向引物。整个microRNA序列除了最后的2个核苷酸都可以用作正向引物,而反向引物可以根据Tm值和GC含量从接头序列中选择。

Q2:如何确定Ct值?理想的Ct值是多少?

John Rasko & Stephane Flamant
循环阈值是由扩增指数期的中部来决定的,大约是在25-35个循环之间,取决于样品和目的microRNA。每一个反应进行三次,同时还有一个阴性的反转录对照。对于每一个检测的样品,我们都用广泛表达的microRNA,如let-7a或miR-21,作为阳性内参。

Thomas Schmittgen
我们应用的是ABI 7900定量PCR仪。通常我们利用软件的默认参数来计算Ct值。对于成熟的microRNA来说,Ct值在20多是正常的(一般在25到30之间)。许多人认为Ct值高于35就代表背景或干扰。我们使用TaqMan探针,它背景很低,因此我们能检测到低水平的microRNA。另一个方法是将实时定量PCR的数据表示为“每个细胞中microRNA的拷贝数”。这在2005年《Nucleic Acids Research》杂志上Caifu Chen的文章中描述过。其中有一些假设,不过它对细胞中microRNA的拷贝数进行了很好的评估。它还有助于了解背景问题。一般说来,每个细胞中microRNA的拷贝数为10或以下就可以认为是背景。

Frank Slack, Phong Trang, & Joanna Weidhaas
我们通常让ABI TaqMan程序来选择循环阈值。如果我们需要手工设定,我想需要依赖阳性和阴性对照。

M.azim Surani & Fuchou Tang
我们通常将表达谱研究中的检测阈值设为恒定的0.2。对于pre-PCR 18个循环扩增的cDNA样品来说,理想的Ct值在10-28之间。如果Ct值大于32,表示cDNA模板的拷贝数很低。一般说来,Ct值大于28时标准偏差相对很大。

Wei Yan
我们利用SYBR green和ABI的7300定量PCR仪进行microRNA定量分析。Ct值是指荧光信号到达阈值水平时的循环数。将阈值水平设定为0.1-0.3时,每个microRNA样品的Ct值可以自动计算。所有的Ct值都取决于目标microRNA的丰度。例如,当使用25ng scrDNA时,let-7的平均Ct值介于17-20之间。

Q3:如何检测miRNA?使用SYBR green吗?

John Rasko & Stephane Flamant
我们是通过TaqMan探针来检测microRNA的。

Thomas Schmittgen
我们利用TaqMan探针来检测成熟的microRNA。对于microRNA前体,我们用SYBR green或TaqMan探针。

Frank Slack, Phong Trang, & Joanna Weidhaas
我们用的是ABI的TaqMan探针,因为它比SYBR green特异性更好。但是也要贵一些。

M.azim Surani & Fuchou Tang
我们用TaqMan探针来检测microRNA的表达。对于多重microRNA分析来说,使用SYBR green降低特异性,并降低了检测的灵敏度,因为在pre-PCR扩增反应中,可能出现引物二聚体。

Wei Yan
对于定量PCR分析,我们利用SYBR green方法,因为它便宜一些,而且准确度和重复性与探针方法差不多。

待续……

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