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Western Blot中的三大常见问题[心得点评]

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2008年09月25日 来源:生物通

摘要:

  Western Blot已经成为实验室中检测蛋白质的常规手段。不过想要得到一张条带清晰、没有杂带、背景干净的图片,还是具有一定挑战性的。我们常常会遇到没有条带、背景过高等问题,没关系,请看本文的问题解答。

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Western Blot已经成为实验室中检测蛋白质的常规手段。不过想要得到一张条带清晰、没有杂带、背景干净的图片,还是具有一定挑战性的。我们在做蛋白电泳和Western Blot时,多数都用的Bio-Rad公司的仪器,所以Bio-Rad蛋白方面的技术专家的确可以称之为专家,因为每天都有很多人向他们请教。他们就将最常见的问题整理成《Western Blotting Troubleshooter》。我们节选了一部分,希望能帮你节省一些查资料的时间。

Q:我的结果是膜上一片空白。为什么会这样?

A:导致这种结果的因素很多。

胶和膜放反了 如果在转印的过程中,胶和膜的位置颠倒了,那么蛋白就从胶上转移到缓冲液中,而不会到达膜上。对于标准的转印,凝胶应靠近三明治的负极,而膜对应正极。

转膜效率低 转膜效率受多种因素影响,包括蛋白的大小、凝胶中丙烯酰胺的百分比、电场强度、转印时间和缓冲液的pH值。一般说来,蛋白越大,转移得越慢。转移大蛋白最好的方法是用高的电场强度。而小蛋白长时间处于高电场强度下可能会穿出转印膜。避免这个问题的方法是用0.2 um孔径的NC膜或PVDF膜进行转印。如果蛋白的等电点接近缓冲液的pH值,那么这个蛋白携带的电荷很少,在电场中也几乎不移动。如果你的目的蛋白是强碱性的,那么你可以用碳酸盐(pH9.9)、CAPS(pH11)及酸性缓冲液。

在转印之后,你可以通过染胶或第二块膜来判断转印效率。为了帮助你直接监控转印效率,Bio-Rad也提供了多种预染Marker,它们在电泳以及转膜之后可直接观察到。

试剂放置太久或存放条件不正确 抗体会慢慢降解,如果反复冻融的话,它会快速降解。底物应储存在-20°C。

抗体不纯或滴度太低 一抗的浓度差异很大,应该根据经验来决定一抗的稀释度。过犹不及,太多的抗体也会阻碍抗原与抗体的结合。一般的原则是以1:100-1:1000来稀释血清或组织培养上清,以1:1000-1:10000来稀释腹水或超免疫动物的血清。Bio-Rad的印迹级别的二抗稀释度是1:3000。

酶失活了 叠氮钠是辣根过氧化物酶的抑制剂。不要在HRP显色的western blot中使用任何含叠氮钠的试剂。叠氮钠可以用于碱性磷酸酶结合的抗体中,而无副作用。另外,自来水或用聚苯乙烯树脂去离子的水也可能会使酶失活,只能使用蒸馏的去离子水。

使用Tween-20洗涤 Tween-20(吐温-20)可能会干扰某些抗体-抗体相互作用,或洗走NC膜上的目的蛋白。尽管在洗涤时它的终浓度只有0.05%-0.1%,但仍可能会影响结合。因此除了封闭之后的第一次洗涤,其他洗涤过程中都不使用Tween-20,不过,这可能会使背景升高。

检测系统缺乏足够的灵敏度 确保蛋白的上样量在检测系统的灵敏度范围内:
    辣根过氧化物酶          500 pg/band
    碱性磷酸酶                100 pg/band
    增强的碱性磷酸酶           5 pg/band
    胶体金                      100 pg/band
    增强的胶体金               10 pg/band
    Immun-Star 化学发光  10 pg/band

Q:我的western blot总是背景过高,如何解决?

A:背景过高可能是由很多因素引起的:封闭不完全、显色过度、洗涤不充分、转移缓冲液或设备有污染、抗体稀释度不对或抗体不纯。

封闭不完全 一抗或二抗只要结合到膜上,就会显色。为了避免非特异性的结合,应用封闭液孵育膜,使所有的空白位点都被封闭蛋白占有。NC膜推荐的封闭液是3%的明胶。在室温孵育1小时。明胶不能在4℃孵育,因为它会凝结。如果想要低温封闭的话,可以用3%的BSA。PVDF膜推荐的封闭液是5%的脱脂奶粉。脱脂奶粉不能与Bio-Rad生物素化的蛋白标准一起使用。脱脂奶粉浓度过高也可能会产生背景。

显色过度 显色时间的长短取决于蛋白条带的数目以及你想要的灵敏度。如果膜在显色液中放置太久,背景就会偏高。应当在蛋白条带清晰可见,而背景几乎没有或很少时,将膜及时取出。
洗涤不充分 在封闭以及抗体孵育之后,至少要洗两次膜,每次5分钟。去污剂的浓度不要太高,否则会把抗原从膜上洗下来。

转移缓冲液或设备污染 使用清洁剂将转印槽内外彻底清洗干净。海绵垫也一定要认真清洗。脏的海绵垫通常是污染的最主要原因。另外,每次转膜时的缓冲液都要是新鲜配制的。

抗体稀释度不正确 一抗的稀释度应根据抗体来源和经验来决定。一般来说,以1:100-1:1000来稀释血清或组织培养上清,以1:1000-1:10000来稀释腹水或超免疫动物的血清。Bio-Rad的印迹级别的二抗稀释度是1:3000。抗体稀释度不够,会产生非特异的结合,带来高背景。

二抗不纯 没有交叉吸附过的二抗可能会与膜上的其他蛋白相互作用,产生杂带。

Q:在转膜的过程中,缓冲液总是很热,我该怎么办?

A:如果缓冲液过热,它就会分解,产生更多的热量。这可是一个大问题。为了避免分解,一定要确保你的冷却设备没问题,使用的是推荐的缓冲液,而且不在过高的功率下转印。

足够的冷却条件 在大部分情况下,都应当使用循环冷却水来进行冷却。在冷库中转印,或将转印槽放置在冰浴中都是不行的。因为大部分转印槽都是塑料做的,不能有效地散热。另外,由于胶附近的缓冲液通常是静止的,在转印过程中应搅动来维持循环。

缓冲液 转印缓冲液的离子浓度必须是已知的,来防止过热。如果离子浓度过高,电压就应该降低(恒流转印),如果是恒压转印的话,就会过热。

功率条件 转印过程中产生的热是与功率成正比的。我们都知道,功率是电压与电流的乘积。P="IE" 而电压、电流和电阻又满足这个等式:R="V/I。当缓冲液分解时,电阻下降。如果电压是恒定的,则电流上升。因此,功率上升,产生更多的热量。如果电流是恒定的,则电压和功率下降,使蛋白转移得更慢。下表就列出了推荐的缓冲液及转膜条件。

缓冲液配方

应用

低电压

适当冷却

过夜转膜

标准电压

适当冷却

转膜5小时

高密度电压

冷却至0-4℃

转膜30分钟-1小时

25 mM Tris

192 mM 甘氨酸

pH 8.3

20% 甲醇

SDS-PAGE

30V0.1A

60V0.21A

100V0.36A

48 mM Tris

39 mM 甘氨酸

pH 9.2

20% 甲醇

SDS-PAGE

30V0.1A

60V0.2A

100V0.43A

10 mM NaHCO3

3 mM Na2CO3

pH 9.9

20% 甲醇

SDS-PAGE中的碱性蛋白

10V0.1A

20V0.25A

30V0.44A


欢迎索取Bio-Rad全能型蛋白转印系统的资料

(生物通 余亮)

延伸阅读:

3款快速转印系统大比拼

3分钟完成蛋白转印 超给力

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