荧光蛋白的过去、现在和未来[创新技巧]

【字体: 时间:2009年11月25日 来源:生物通

编辑推荐:

  1962-2009,这47年来,荧光蛋白也在不断进化。不过这种进化不是出于自然选择,而是成像上的压力。对于体内成像而言,颜色当然是越红越好。于是,绿色荧光蛋白的颜色慢慢向红色偏移,最初是黄色,再到后来的橙色和红色。

2008年10月8日,诺贝尔化学奖揭晓。日本科学家下村修、美国科学家马丁•查尔非和钱永健因发现和改造绿色荧光蛋白(GFP)而获奖。因诺贝尔奖和钱永健,荧光蛋白再次成为我们关注的热点。1962-2009,这47年来,荧光蛋白也在不断进化。不过这种进化不是出于自然选择,而是成像上的压力。

让我们先来了解一些关于始祖GFP的基本情况。GFP由238个氨基酸组成,分子量为26.9 kDa,最初是从维多利亚多管发光水母(Aequorea victoria)中分离出来的,在蓝光照射下会发出绿色荧光。来源于水母的野生型GFP在395 nm和475 nm分别有主要和次要的激发峰,它的发射峰在509 nm,处于可见光谱的绿色区域。来源于海肾的GFP只在498 nm有单个激发峰。

GFP是典型的β桶形结构,包含β折叠和α螺旋,将荧光基团包含在其中。严密的桶形结构保护着荧光基团,防止它被周围环境淬灭,内部面向桶形的侧链诱导Ser65–Tyr66–Gly67三肽环化,导致荧光基团形成。

1962年,下村修和约翰森从维多利亚多管水母中分离生物发光蛋白-水母素(aequorin)时,意外地得到了一个副产物。它在阳光下呈绿色、钨丝下呈黄色、紫外光下发强烈绿色。其后他们仔细研究了其发光特性。1974年,他们得到了这个蛋白,当时称绿色蛋白,以后称绿色荧光蛋白(GFP)。GFP在水母中之所以能发光,是因为水母素和GFP之间发生了能量转移。水母素在钙刺激下发光,其能量可转移到GFP,刺激GFP发光。这是物理化学中已知的荧光共振能量转移(FRET)在生物中的发现。

研究者们并没有意识到GFP的应用前景,慢慢就将其遗忘了。这一晃就是20年。直到1992年,道格拉斯•普瑞舍克隆并测序了野生型的GFP,文章发表在《Gene》杂志上。但具有讽刺意味的是,基金评审委员会认为普瑞舍的工作没有意义,不愿提供经费。普瑞舍一气之下,离开了科学界,将GFP的cDNA送给了几个实验室。很多人尝试用GFP的基因来表达蛋白,但都失败了。马丁•查尔非就考虑只用它的编码区域来表达。他用PCR的方法扩增了GFP的编码区,将它克隆到表达载体中,通过UV或蓝光激发,在大肠杆菌和线虫细胞内均产生了很美妙的绿色荧光。这才是GFP作为荧光指示剂的真正突破,文章发表在《Science》杂志上。

尽管野生型GFP发出很绚丽的荧光,但它还是有不少缺点,比如有两个激发峰、光稳定性不好,在37℃不能正确折叠。

1996年Remington小组最先在《Science》上发布了GFP的S65T突变体的晶体结构。一个月后,Phillips小组也在《Nature Biotech》上发布了野生型的GFP结构。正是这些晶体结构的探明,才使人们更好地了解发光基团的组成,以及与周围残基的相互作用。研究人员通过定点或随机突变,不断地改造这些残基,得到了我们今天使用的GFP衍生物。

首个重大改变就是钱永健在1995年完成的单点突变(S65T)。这个突变显著提高了GFP的光谱性质,荧光强度和光稳定性也大大增强。突变后的GFP激发峰转移至488 nm,而发射峰仍保持在509 nm,这和常用的FITC滤光片匹配,提高了GFP的应用潜力。而F64L点突变则改善了GFP在37℃的折叠能力,综上就产生了增强型GFP,也就是我们常见的EGFP。

荧光蛋白的改造遵循这样一个宗旨,那就是越红越好。普遍认为,长波长光子的激发对细胞和组织的光毒性小,且自体荧光和动物组织的光吸收都是最小。这些因素意味着红色的荧光基团对比度提高(因为背景应该降低),且更适合于体内成像。于是,荧光蛋白的改造慢慢向红色偏移。最初是黄色荧光蛋白,1999年人们在银莲花中发现了橙红色的荧光蛋白同源物,称之为DsRed(发射峰在583 nm)。DsRed的出现让研究人员认识到荧光蛋白的多样性,同时也有了更丰富的改造模板。之后,更长波长的荧光蛋白也陆续出现,如mStrawberry、mCherry(2004)、mApple(2008)、mRuby(2009),它们的名字也都相当动听。

对于活体动物成像而言,最好工具是远红外荧光蛋白。然而,要产生远红外荧光,这些蛋白需要被600 nm左右或以上的光激发,但这些光在到达深处的组织之前,就已被血红蛋白大幅度减弱。因此,到现在为止还未开发出激发光谱在700 nm附近的荧光蛋白。远红外荧光蛋白的开发遇到了瓶颈。

实际上,大自然蕴含的丰富资源已经解决了这个问题,只是我们不知道而已。钱永健的实验室最近揭开了谜底。他们没有像惯常一样,从红色荧光蛋白开始,将它们改造得更亮,而是从一种新的骨架来开发红外荧光蛋白。他们从一种耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans)的细菌光敏色素骨架入手,这种光敏色素吸收700 nm左右的光。它还结合了一种名为胆绿素的辅因子,作为发色团。

利用饱和突变和DNA改组(DNA shuffling)来改变胆绿素发色团的蛋白残基,钱永健及他的同事们发现了一种光稳定的红外荧光蛋白突变单体,它的激发波长是684 nm,发射波长是708 nm。当他们利用腺病毒载体在小鼠肝脏表达这种突变体时,观察到强烈的红外荧光。

除了体内成像应用,这种红外荧光蛋白还能用于细胞成像。它的颜色与目前存在的荧光蛋白不同。而且,红外区域的细胞自体荧光几乎是不存在的,因此提供了更清晰的图像。此外,它还能在荧光共振能量转移(FRET)中发挥作用。钱永健实验室的研究人员表示,红外荧光蛋白应该不会局限于耐辐射奇球菌的光敏色素,还存在许多种细菌光敏色素,它们的吸收最大值在650到750 nm之间。这些也是红外荧光蛋白的有力候选,它们能用于多色成像、以及体内FRET成像的供体或受体。

绿色荧光蛋白不再是孤独的,它有了橙色、红色等多种荧光蛋白的陪伴。然而,要找到个“门当户对”的伴侣也不容易。就融合应用、亮度、光稳定性而言,与EGFP相似的还真没有。而且,一些红外荧光蛋白仍保留了基本的绿色荧光组件,因此不可能与EGFP一起应用于两色成像。科学家的近期目标是开发出与EGFP各方面都匹配的红色荧光蛋白。当然,红色荧光蛋白变异体的改造仍在持续。

荧光蛋白已经给生物学带来了很多惊喜。通过常规的基因操纵手段,用荧光蛋白来标记其他目标蛋白,这样就可观察、跟踪目标蛋白的时间、空间变化,提供了以前不能达到的时间和空间分辨率,而且可以在活细胞、活体动物中观察到一些分子。荧光蛋白甚至协助了HIV研究。

德国的研究人员就开发出一种光转变荧光蛋白(photoconvertible fluorescent protein),能观察HIV在感染的细胞中如何装配及释放。这种名为EosFP的光转变蛋白发出强烈的绿色荧光,在紫外照射下会转变为红色。紫外光通过打断发色团旁边的肽骨架而改变了蛋白的发射波长。这样EosFP就称为一种极佳的失踪标记。研究人员将EosFP与HIV的结构蛋白-Gag相连,实时追踪了病毒颗粒在感染的细胞膜上如何装配并释放。光转变荧光蛋白让研究人员又多了一种选择。

荧光蛋白的下一个惊喜将会是什么?我们无法回答,但我们期待着。

相关阅读:

荧光知识充电站

核酸荧光染料 不光灵敏,更要安全

蛋白荧光染料大比拼


订阅生物通快讯

订阅快讯:

最新文章

限时促销

会展信息

关注订阅号/掌握最新资讯

今日动态 | 人才市场 | 新技术专栏 | 中国科学人 | 云展台 | BioHot | 云讲堂直播 | 会展中心 | 特价专栏 | 技术快讯 | 免费试用

版权所有 生物通

Copyright© eBiotrade.com, All Rights Reserved

联系信箱:

粤ICP备09063491号