Acumen eX3在肿瘤学研究中的应用[创新技巧]

TTP LabTech公司出品的Acumen eX3高通量化高内涵筛选平台有着流式细胞仪无法比拟的通量。整个384孔板的读取只需要10分钟，这其中还包括了多重分析，比如有丝分裂指数的确定。目前，Acumen广泛应用在肿瘤学研究中的多个领域，如蛋白激酶图谱分析、细胞增殖、克隆形成、细胞毒性、凋亡、细胞粘附、血管生成等等。本文就详细描述了Acumen在几个关键领域的应用。

1. 简介
根据卫生部2008年发布的调查报告，恶性肿瘤已成为我国城市的首位死因，且我国恶性肿瘤死亡率属于世界较高水平。如何擒拿这个“头号杀手”？这给肿瘤学的研究人员布置了一道难题。好在，我们有很多工具可以利用，比如近来渐趋流行的高内涵分析。肿瘤学研究很容易采用高内涵分析，因为它与多个高内涵的应用直接相关。例如，任一种癌症治疗的主要目标都是杀死癌细胞，那么也就离不开细胞毒性、细胞增殖与凋亡等分析。传统的分析工具包括流式细胞仪和显微镜成像系统，然而，激光扫描微孔板细胞仪却有着更多的优势。

就拿肿瘤学中常见的细胞周期分析来举个例子。TTP LabTech公司出品的Acumen eX3高通量化高内涵筛选平台有着流式细胞仪无法比拟的通量。整个384孔板的读取只需要10分钟，这其中还包括了多重分析，比如有丝分裂指数的确定。流式细胞仪只能分析细胞悬液，而Acumen eX3则能够在原位分析贴壁细胞，保留了细胞在处理过程中所发生的形态变化。光这两点就已经很有吸引力了，当然，Acumen的应用也不仅是细胞周期分析，还包括肿瘤学研究中的多个应用，如蛋白激酶图谱分析、细胞增殖、克隆形成、细胞毒性、凋亡、细胞粘附、血管生成等等。本文就详细描述了Acumen在几个关键领域的应用。

2. 蛋白激酶图谱分析
蛋白激酶在许多信号通路如增殖、分化和凋亡中起了重要的调节作用。目前已鉴定的人类激酶有518种，这表示我们有很大的机会去发现新的激酶通路。过去，研究激酶通路常采用体外分析法，也就是利用放射性标记的ATP来检测结合事件。这些方法非常灵敏，但局限于通量低，且使用不讨人喜欢的同位素。另一个问题就是蛋白从体内分离出来后，它起作用的方式可能会改变。反应中可能会缺少了某些对整个细胞功能很关键的成分，比如支架蛋白（scaffold protein）。

研究显示，支架蛋白将激酶通路中各个组分拉到一块，从而实现了特异的细胞内相互作用。（如图2.1）。JIP-1（JNK相互作用蛋白-1）就是这样一种哺乳动物的支架蛋白，它是MLK、MKK7和JNK特异的，能促进这些酶的活化。在全细胞的环境中，通路激活所需的所有成分都是以天然的数量存在，自然也就排除了理论配比失衡。利用全细胞分析，就有可能鉴定出在接头蛋白位点起作用的化合物，从而有助于新药的开发。

图2.1 JIP-1充当支架蛋白，将MLK、MKK7和JNK拉到一起。
A．接头蛋白未受刺激，激酶就不能停靠，因此不足以局部化形成激酶级联。
B．一旦支架蛋白激活，就发生构象改变，允许激酶级联的组分结合到接头蛋白上，让它们足够接近并激活。

在大多数化合物都被排除之后，基于细胞的高内涵分析广泛应用于第二轮的激酶活性图谱分析。由于现有技术的低通量，它们在高通量筛选中的应用面临巨大的挑战。对于高内涵激酶分析而言，也有一个额外的难题，那就是免疫检测所需的固定步骤有很多步，非常耗时。

激光扫描高通量化高内涵筛选平台，如Acumen eX3，将CCD成像仪的目标识别能力与荧光读板机的快速读取能力相结合, 从而突破性地把对细胞水平的筛选应用到初筛领域，如蛋白激酶及它们对细胞周期调控的初筛（图2.2、图2.3）。此外，利用激酶的抗体或GFP标签蛋白还能直接定量激酶活化所产生的蛋白转位（图2.4、图2.5）。而Acumen对细胞数量的要求也不高，每孔中1000-2000个细胞均可，降低了对细胞培养的要求。

图2.2 CHO细胞暴露在茴香霉素中5分钟，然后固定。利用抗磷酸化-p44/42 MAP激酶抗体和羊抗兔TIFC二抗来检测ERK的激活。左为对照细胞，右为处理细胞。上图FITC只显示出活化的细胞，下图Syto64显示出总细胞数。

图2.3 CHO细胞暴露在茴香霉素中35分钟，然后固定。利用抗磷酸化-p54 JNK抗体和羊抗兔TIFC二抗来检测JNK的激活。EC50 = 450 nM

图2.4 NFkB 蛋白转运分析。使用Alexa Fluor 488标记的NFkB抗体检测，使用PI对细胞核进行染色。

图2.5 Acumen eX3软件显示GFP偶联的蛋白激酶在细胞质与细胞核之间的转运。A. 对照；B. 激活。

Acumen eX3的全孔扫描能力能够在高通量的前提下对每个孔中的每个细胞进行高内涵分析。这种对全体细胞进行分析的模式（而非像其它仪器的每孔取点采样分析模式）对于激酶图谱分析来说益处良多。首先，综合所有细胞，可以它能够克服免疫染色后细胞随机分布的问题，产生统计学上可靠的数据；其次，全孔扫描还能够可以得出全体细胞数，计算出生物反应对细胞总数的比例，从而实现归一化分析，故可以算出所测定细胞生物反应在全体细胞中百分比从而实现数据的均一化分析每个细胞生物反应的标准化，对每次检测可以非常方便地得出给出一个简单的毒性或增殖的读数。而Acumen eX3仪器的多道激光（405nm，488nm和633nm）和多通道检测（每道激光最高四通道同时检测，这意味着理论上可进行12通道色实验）进一步扩大了荧光探针和蛋白的范围，让激酶图谱分析也能多重化。

3. 细胞周期分析
细胞周期代表了真核细胞中最基本也是最重要的过程之一。此过程被细胞质中的蛋白严格调控，主要是细胞周期蛋白（cyclin）和cyclin依赖的激酶，让细胞有序地从G1、S、G2一直发展到M期。细胞周期调控的缺陷是肿瘤细胞的典型特征，在癌症中经常会发现参与细胞周期调控的基因发生了突变。这也为开发抗癌药物的新靶点提供了很好的机会。因此，研究人员对细胞周期调控异常的兴趣日益增长。

不断加速药物开发进程的迫切要求催生了多种高通量筛选技术。这也让通过初筛的化合物数量显著增加，而在某些研究领域复筛成了瓶颈，因为复筛由于当时技术和设备的限制只能应用低通量的分析。细胞周期分析就是其中一个。传统的方法是利用流式细胞仪来定量细胞中总的DNA含量。DNA含量的测定是流式细胞仪最早的应用之一，至今仍是最普遍的应用之一。这要归因于流式细胞仪固有的高灵敏度，以及科研和临床应用中有那么多久经考验的操作方法。然而对于筛选来说，流式细胞仪并不完美。因为它通量低，需要大量细胞，而且不能在原位分析贴壁细胞系，需要重悬细胞，耗时费力。

传统的方法是用荧光染料对固定细胞的核进行染色，来测量DNA含量的变化。随后，流式细胞仪根据荧光强度将细胞分为G1、S和G2/M期。由于G2和M期的细胞有着相同的DNA含量，因此光凭DNA染色不能分辨它们。最常用的染料是碘化丙啶（PI），它插入DNA双螺旋，并发出强烈的红色荧光。它是由488 nm的光激发，因而适用于大部分流式和微孔板细胞仪。PI不能渗透完整的细胞膜，因此细胞在一开始就必须经过透化处理。PI还会对双链RNA进行染色，这样还需要用到RNase。

基于以上的种种不便，TTP LabTech开发出一种全新的利用Acumen eX3的细胞周期分析方法，能够在10分钟以内读取整个96、384、1536孔板（Acumen 特有的按面积扫描模式使得96，384与1536孔的扫描时间基本相同）。这种方法的另一个最主要优势是能够在原位分析贴壁细胞，而不像流式细胞仪那样需要将细胞悬浮。原位读板保留了药物处理过程中可能发生的形态改变，还能够分析外形，并确定细胞核的定位。这些信息能看见有丝分裂晚期的多个细胞核，将G2期的细胞分辨出来。此外，它还能进行细胞周期和有丝分裂指数的多重测定。固定细胞用PI和抗磷酸化组蛋白H3的抗体染色后，利用488 nm的光激发，能同时分析两种参数（图3.1）。
 

图3.1 固定细胞用PI（细胞周期分析）和抗磷酸化组蛋白H3（FITC结合，有丝分裂指数）染色，两个分析在Acumen eX3上同时进行。

激光扫描的优势在于它能产生荧光物体的三维模型，包括细胞核。研究人员已经开发出数学模型，从单个的DNA柱状图来计算细胞周期中不同时期的细胞比例（图3.2）。对于筛选应用，Acumen eX3的通量是无可比拟的，它几个小时就能完成流式细胞仪一个星期才能做完的工作。所有的细胞处理都是在微孔板中进行，因此也很容易上升到自动化。曾有报道指出，利用Acumen eX3高通量化高内涵筛选平台一天能筛选300000个化合物。因此，它也非常适合于基因组范围的RNAi图谱分析。今后，TTP将会开发多重细胞周期分析的验证步骤，将常规的周期分析与有丝分裂指数和蛋白转位分析结合起来，而后者已经超出了流式细胞仪的能力范围。
 

图3.2 HeLa细胞（每孔2,000个细胞）原位标记用于细胞周期检测。A, PI染色（10 uM）； B, Hoechst 34580染色（10 uM）；C, Vybrant DyeCycleTM Orange染色（5 uM）；D,  TO-PRO-3染色（0.5 uM）。 在一台Acumen eX3上分别使用405, 488 and 633 nm激光激发。

4. 细胞克隆形成
作为细胞毒性的参数，细胞克隆形成被认为比细胞活力更为灵敏，因为克隆形成是在细胞处于增殖状态时评估的，所以更易受毒性作用的影响。过去，克隆计数是在半固体的琼脂糖双层系统上进行的，还要在显微镜下一个一个地数。当然，这其中就会有主观因素的影响。后来，出现了更高级的图像分析系统，但是由于它的景深有限，不能准确分辨大体积的克隆；而且它的成像面积较小，通常为1 mm×1 mm，因而不能对全孔进行克隆计数；最后由于需要多点成像，导致检测速度很慢。

现在，研究人员转而利用Acumen eX3来确定细胞生长抑制剂-星形孢菌素对HT1080细胞克隆形成的影响。Acumen eX3能够自动地对24或96孔板进行高内涵的全孔扫描。它的软件应用体积算法来确定克隆数量。这种算法利用扫描目标之间的最大和最小距离来估计细胞的体积。研究表明体积更能代表体内细胞克隆的形成，因为它与肿瘤生长的相关性更好。

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利用Acumen eX3，细胞培养物在经过calcein-AM染色后，可在选定的时间点来监测克隆形成。对照孔内含有指定数量细胞的克隆。这种技术的主要优势之一是用户能区分细胞簇和克隆，从而可靠地确定细胞数量。一般来说，目的细胞克隆被认为含有20个以上的细胞（图4.1，红色），而细胞簇不足20个细胞（图4.1，绿色）。传统的格子计数法对于某些克隆来说就会显得无计可施（如图4.1中的克隆2）。而Acumen eX3鉴定了孔中的所有荧光目标，这也意味着所有克隆都能被准确地鉴定和分类。在表4.1中显示了图4.1中标记的3个克隆的面积和体积测量结果（表4.1）。通过比较可以发现，使用面积作为测量参数相对于使用体积作为测量参数，低估了克隆的尺寸。例如，克隆2的体积/面积比要远远大于克隆1和克隆3，这可以归咎于克隆的形状和其在孔中的分布方向。
 

图4.1 Acumen eX3软件的全孔观察显示出细胞克隆的鉴定及分类。

表4.1 图4.1中的3个克隆的数据以及体积/面积比。

Colony number	Area (µm2)	Volume (µm3)	Volume:Area Ratio
1	14256	1718643	121
2	30524	29877492	979
3	1870	62022	33

5. 血管生成
癌症研究人员在研究癌症转移所必需的条件时，发现其中一个必要的事件就是新的血管网络的生成，这个过程也称为血管生成（angiogenesis）。肿瘤的血管生成是指血管网络的增殖，这些血管渗透到癌生长物中，为之提供营养和氧气，并带走废物。肿瘤的血管生成实际上始于肿瘤细胞所释放的分子，它们向周围的正常组织发送信号（表5.1）。这些信号激活了宿主组织中的某些基因，它们再生成蛋白来促进新血管的生长。研究人员已经鉴定出十几个这样的蛋白和一些小分子。在这些分子中，有两种蛋白似乎对维持肿瘤生长最为重要，它们分别是血管内皮生长因子（VEGF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）。多种癌细胞和某些类型的正常细胞都产生VEGF和bFGF。

根据以上研究结论，药物研发人员自然会想到去干扰肿瘤的血管生成，作为癌症治疗的有力手段。利用Acumen eX3能够筛选调节血管生成的化合物，这个过程相当简单。仪器的大视场能分析多种规格的微孔板，当然最常见的是24或96孔板。在生长因子刺激后，细胞用calcein-AM染色，而血管生成的数量就可轻松确定。如果是初筛，可选择细胞仪模式，会得到总的血管面积；如果是二次筛选，则选择成像模式，除了血管面积，还能了解总的血管长度以及数量（表5.2、图5.1、图5.2）。

表5.1 自然状态下激活angiogenesis的因素.

蛋白

小分子

·         Acidic fibroblast growth factor ·         Angiogenin ·         Basic fibroblast growth factor ·         Epidermal growth factor ·         Granulocyte colony-stimulating factor ·         Hepatocyte growth factor ·         Interleukin 8 ·         Placental growth factor ·         Platelet-derived endothelial growth factor ·         Scatter factor ·         Transforming growth factor alpha ·         Tumour necrosis factor alpha ·         Vascular endothelial growth factor (VEGF)

·         Adenosine ·         Butyryl glycerol ·         Nicotinamide ·         Prostaglandins E1 and E2

表5.2 在Acumen eX3上进行angiogenesis实验所使用模式的总结

分析模式	细胞计数	成像
Application	Primary Screening	Secondary Screening
Staining	Calcein-AM	Calcein-AM
Readouts	Total tube area	Total tube area Total tube length Number of tubes

图5.1 细胞计数模式下，Acumen eX3软件显示的angiogenesis结果。A. 对照；B. 生长因子刺激。

图5.2 成像模式下的数据分析。A. Acumen eX3软件的原始TIFF图像。B. 利用Image Analysis软件对血管进行分类。

6. 细胞迁移
细胞迁移是高度综合、多个步骤的过程。调控异常的细胞迁移涉及到癌症、黄斑退化和糖尿病伤口愈合。了解细胞移动的过程能为多种疾病状态的管理提供重要的视角。

近年来，研究人员设计出越来越精细的方法，来研究微孔板中细胞的运动，以取代Boyden小室。一些方法关注于细胞向无细胞领域的移动。研究人员开发出两种微孔板的方法，都与Acumen eX3兼容，尤其考虑到它的大区域扫描功能。

划痕分析
在这个方法中，细胞培养在微孔板中，直到出现汇合的单层，然后将孔中心长方形或十字形区域的细胞移走。这是通过适当的工具如移液管吸头“划痕”单层细胞来实现的。一些研究人员使用机器人的96 SBS形式移液头，同时处理96个孔。然后加入活细胞染料如calcein-AM，并用Acumen eX3扫描来进行分析，以确定划痕的闭合程度。

图6.1 BCPC3细胞培养在96孔板中，形成单层，并用CMFDA活性染料来染色。利用96浮动针头工具划痕单层细胞。随后用Acumen eX3扫描平板，以确定0时的划痕区域。添加生长因子，继续培养细胞16小时，让细胞填充划痕区域。再次用Acumen eX3扫描平板，以确定填充的比例。数据来自礼来公司的Mark Uhlik。

Oris 细胞迁移分析
Oris 细胞迁移分析（www.platpustech.com）利用独特的细胞接种塞来产生一个能观察细胞迁移和侵袭的检测区域。硅胶塞插入96孔板的每个孔中，接种后4-18个小时贴壁细胞形成一个环。去除硅胶塞，可见单层细胞的中心有均一的圆形检测区域（直径2 mm），细胞会向此区域迁移。

TTP LabTech与Platpus Technologies合作，实现了Acumen eX3的分析。考虑到仪器的大视场和细胞计数分析，这变得相当简单。

Platpus Technologies现在还提供了此试剂盒的细胞侵袭版本，以便研究细胞通过细胞外基质的迁移。

图6.2 利用Oris 细胞迁移分析进行的细胞迁移分析，并在Acumen eX3上分析。

7. 组织扫描
TTP LabTech还将Acumen eX3应用于载玻片上的组织切片扫描。这项工作的目标是对标记了荧光染料的组织样品进行自动化的病理分析。

研究人员已经实现了几个关键突破。首先是准确定位载玻片上的组织样本，让它们位于Acumen eX3的扫描区域内。有两种方法可以实现，如图7.1所示。A是一种定位架，用户可利用上面刻着的网格来定位样品。B则是一种印好的载玻片，有两个扫描区域。研究人员预计，印好的载玻片会更适合高通量荧光免疫组化研究，因为它们能浸泡在水浴中以便于组织切片的回收。

图7.1 定位载玻片中组织的装置。

此外，研究人员还设计出两种新颖的载玻片支架，能对4块载玻片进行扫描（图7.2）。这两种支架分别从顶部（A）或底部（B）插入载玻片，如果有平板操作机器人的话，还能自动将支架放入Acumen eX3。这样，用户就能对4块玻片上的8个指定区域进行扫描。Acumen eX3的软件（3.3版）已经过升级，能确保兼容性。

图7.2 利用Acumen eX3进行玻片扫描的支架。

Acumen eX3已帮助研究人员获得染色后组织切片的定性图像。数据能作为TIFF图像导出，用于下一步的病理学分析。最近，礼来等公司还用它进行了肿瘤组织切片中的生物标志物检测。肿瘤组织经抗磷酸化组蛋白H3抗体（有丝分裂指数）以及PI（DNA）的染色，如图7.3所示。标准Acumen eX3软件所产生的高内涵数据甚至可与商业化的图像处理软件相媲美。

图7.3 利用Acumen eX3来分析实体瘤的有丝分裂指数。A. 整个肿瘤切片的视图。B. 呈现特异有丝分裂细胞染色的组织切片的放大。

总结
当然，高通量化高内涵筛选平台在肿瘤学中的应用还远不止以上这些。它还能对玻片上的组织切片进行扫描和成像，也可以利用蛋白抗体来确定激酶从胞质到核的转位，研究其激活。另外，也可以监测带有GFP标签的蛋白，从而实现更简单的自动筛选。至于细胞凋亡、增殖、毒性分析，那更是不在话下。Acumen eX3高通量化高内涵筛选平台以其快速、原位及多重分析的优势，正在肿瘤学中发挥着日益重要的作用。

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背景资料
著名的实验仪器厂商TTP LabTech公司将创新的Acumen eX3推向全球市场以来，Acumen已经成为对高涵量药物筛选进行高通量分析的市场领先者，主要安装在多个跨国制药企业研发中心和国家级的科研机构，其中中国办事处自2008年设立以来一年内就已经在国内市场售出了5台。Acumen现在发展到的第三代产品已为那些需要进行多重荧光分析和提高细胞荧光分析通量的机构建立了可靠的行业标准，并使这些分析更容易进入初筛领域。
Acumen高内涵高通量平台的应用

TTP LabTech的Acumen eX3为基于细胞的分析筛选提供了非常灵活的方法。这种技术产生了高通量、高涵量及高度多元化的数据，广泛适用于各种生物分析。

Acumen eX3已被应用于药物开发进程的各阶段，并凭借它的灵活性优势被广泛应用于多种生物学应用中的定量分析中，包括毒性检测、病毒传染性、细胞周期、细胞增殖、蛋白激酶活性和报告基因分析。

技术应用范围包括：

脂肪生成	凝集素结合
血管生成	脂肪累积
凋亡	有丝分裂指数
细胞粘附	迁移
细胞周期分析	P-糖蛋白
线虫分型	吞噬作用
细胞分化	磷脂沉积
细胞增殖	蛋白激酶图谱
细胞伸展	蛋白转位
克隆形成	蛋白酶体分析
细胞毒性	报告基因激活
GPCR筛选包括：	RNAi文库图谱
--- Bioimage公司 Redistribution®高涵量路径分析中侦测细胞内蛋白质转位的专利技术 --- Transfluor® GPCR药物开发技术 --- β-内酰胺酶	脂肪变性
	干细胞分型
	组织扫描和成像
杂交瘤筛选	病毒感染性

 

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