DeadEnd(TM)比色法凋亡检测系统:在病理学中的应用[创新技巧]

【字体: 时间:2009年02月26日 来源:Promega

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  由于凋亡在发育、自我稳态调节和多种重大疾病中扮演着重要角色,因此对凋亡的遗传、分子和形态学方面的研究正在深入地进行。Promega的DeadEnd(TM)比色法凋亡检测系统对凋亡的生化标志物 — 片断化降解的DNA进行标记。这一比色系统很适合对组织切片和培养细胞中的凋亡细胞的胞核进行标记,而且还可以同时进行形态学评估。本文展示了DeadEnd(TM)凋亡系统在凋亡的细胞模型、动物模型和多种病理组织切片中的应用。

作者:Martha O'Brien, Angela Okragly, Promega Corporation; Tom Warner, Ron Kalil, University of Wisconsin Medical School; Guus Wolswijk, Netherlands Institute for Brain Research, Amsterdam, The Netherlands

由于凋亡在发育、自我稳态调节和多种重大疾病中扮演着重要角色,因此对凋亡的遗传、分子和形态学方面的研究正在深入地进行。Promega的DeadEndTM Colorimetric Apoptosis Detection System(以下称DeadEndTM比色法凋亡检测系统)对凋亡的生化标志物 — 片断化降解的DNA进行标记。这一比色系统很适合对组织切片和培养细胞中的凋亡细胞的胞核进行标记,而且还可以同时进行形态学评估。本文展示了DeadEndTM凋亡系统在凋亡的细胞模型、动物模型和多种病理组织切片中的应用。

简介
凋亡是一种细胞自杀机制,是一种固有的生物学事件,在发育、自我稳态调节和多种疾病过程中扮演着重要角色。正常发育的一个重要方面就是以精确而系统的方式剔除过剩的细胞。因此,此过程又叫做程序性细胞死亡。但是,在一些疾病中,细胞死亡程序会发生错误。退行性疾病可能会导致细胞的过度凋亡,细胞的过度凋亡也可导致退行性疾病。一些癌症抑制了细胞死亡的级联反应,导致细胞出现过度的、不可控的增殖。

最初,凋亡定义的是细胞形态学的变化,如细胞体积减少、细胞核浓集和胞膜出泡。经历凋亡的细胞降解成膜彼此相连的凋亡小体,此时,这些凋亡小体可被巨噬细胞或其它临近的细胞所吞噬,而不产生炎症反应。这一过程与坏死完全不同,坏死是细胞遭受严重损伤所导致的,其特征是细胞肿胀、溶酶体酶类释放、细胞膜完整性丧失和炎症反应等。

许多类型的细胞都会发生凋亡,并且可以被多种胞外刺激物触发。研究发现几个细胞死亡基因在不同物种间非常保守,针对细胞死亡通路的研究正在不断深入。在凋亡细胞中会观察到细胞核发生形态学变化,在内源性核酸内切酶的作用下使DNA降解成片断(1,2),这些酶包括caspase依赖的DNase,即CAD(3)。这种DNA片断化降解是凋亡的重要标志。通常,凋亡细胞内的DNA 被切割成为长度大小为180-220bp的整数倍的很多个DNA片断。这些片断在琼脂糖凝胶电泳中呈现出“梯子型”,很容易被观察到。

DeadEndTM比色法凋亡检测系统可以对凋亡细胞的降解DNA进行末端标记。本系统以改进的TUNEL方法为基础,TUNEL为TdT介导的dUTP缺口末端标记法(TdT-mediated dUTP nick end-labeling)的简称。图1所示为检测步骤。DeadEndTM系统对培养细胞和组织切片的DNA降解片段都可进行原位标记(4)。使用这一方法,凋亡细胞核被染成深褐色。

图1. DeadEndTM比色法凋亡检测系统使用方法概述
 
凋亡的细胞模型

Fas介导的细胞死亡模型是已建立的、较好的凋亡模型。Fas配体(FasL)结合于Fas受体或受体的交联抗体后可以启动这一模型(5,6)。配体结合后几小时内就可以观察到Fas介导的细胞死亡,这一过程不需要蛋白质合成(5,7)。普遍认为Fas连接作用激活了蛋白酶的级联反应,最终转换成细胞死亡信号(8)。Jurkat细胞为人T淋巴细胞,我们使用了抗体交联的Fas致使Jurkat 细胞发生凋亡,并以此为模型,验证了Promenga的DeadEndTM比色法凋亡检测系统的效用。如图2所示,使用抗Fas处理后,DeadEndTM比色法凋亡检测系统可将许多凋亡细胞标记出来,而未经处理的对照组细胞几乎都没有被标记上。

图2.抗Fas单克隆抗体(50ng/ml;CH-11克隆,Oncor)诱导的Jurkat细胞凋亡。细胞经Fas mAb 处理后(16小时),使用DeadEndTM比色法凋亡检测系统标记凋亡细胞的胞核。未处理的对照组细胞无着色(插图)。

此外,实验还先后使用了Promega公司的CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (以下称CellTiter® 96 AQueous单溶液细胞增殖检测试剂盒)(a)和CytoTox 96® Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (以下称CytoTox® 96 非放射性细胞毒检测试剂盒),来检测凋亡诱导后16小时的细胞活力(图3)。CellTiter® 96 AQueous试剂盒检测的是四唑盐MTS(a)的生物还原,从而对细胞活力进行定量检测(9)。CytoTox® 96 试剂盒检测的是细胞膜被破坏后,从细胞内漏出的乳酸脱氢酶(LDH)。如图3所示,CellTiter® 96 AQueous试剂盒检测的结果是:随着诱导Jurkat细胞凋亡加入的Fas mAb的增多,活细胞总数降低;而同时使用的CytoTox® 96试剂盒检测的结果是死亡细胞总数增加。在这一Fas介导的Jurkat细胞凋亡模型中,上述两种方法的检测结果与使用DeadEndTM检测系统所检测的凋亡情况是一致的(图2和3)。在使用茴香霉素诱导HL-60细胞的凋亡时也观察到了相似的结果,证实了CellTiter® 96 AQueous试剂盒、CytoTox® 96试剂盒以及CaspACETM荧光检测系统的检测结果具有一致性(11)。

图3. 不同浓度的抗Fas mAb诱导的Jurkat细胞凋亡。将Jurkat细胞调整浓度至106个/ml,加入0-50 ng/ml不同浓度的抗Fas mAb,用于诱导凋亡。在含5%的CO2 培养箱中,37℃孵育,16小时后,按照每种试剂盒提供的操作方案,使用CellTiter® 96 AQueous单溶液细胞增殖检测试剂盒(490nm吸光度)和CytoTox® 96非放射性细胞毒检测试剂盒(LDH最大释放的百分比)检测细胞活力状态(9,10)。

凋亡的动物模型
凋亡的动物模型对研究体内细胞的程序性死亡通路非常有用。研究人员已经建立了神经元轴索显微手术导致大鼠脑神经元死亡的模型,用于凋亡研究。大鼠脑部视觉皮层的单侧损伤会导致与损伤同侧的外侧膝状体核(LGN)的神经元广泛死亡(12,13)。经轴索显微手术处理的LGN神经元,在诱导损伤后的精确时间点出现萎缩和死亡。轴索显微手术诱导细胞凋亡的时程表明:损伤后3天,损伤同侧的LGN神经元仅有5%发生死亡;但是,在损伤后3-7天,则出现广泛的神经元死亡。在此期间,背部同侧的LGN约有2/3的神经元出现细胞死亡(12)。在图4中,损伤同侧LGN的多数细胞核都可以被DeadEndTM比色法凋亡检测系统清楚地标记上,而损伤对侧的LGN却未被标记。这些结果清楚地表明这一凋亡检测系统可以有效地标记轴索显微手术诱导的神经元死亡模型的凋亡细胞核。

图4. 在轴索显微手术诱导凋亡的大鼠脑模型中,使用DeadEndTM比色法凋亡检测系统标记背外侧膝状核(LGN)的凋亡细胞核(11,12)。使用多聚甲醛/戊二醛固定大鼠脑,振动切片机切片(50μm),进行轴索显微手术的大脑LGN出现几个深染细胞,而在同一张切片(插图)上的对侧LGN则没有观察到深染细胞。图片中的“洗衣板”效应是振动切片所造成的人为现象。

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人类疾病中的凋亡
理解许多疾病状态相关的细胞死亡过程对于解决发病机理和找出可能的治疗方案是至关重要的。在许多疾病中,细胞的死亡是由于凋亡引起还是由其它的溶细胞途径引起,还不十分清楚。我们使用了DeadEndTM比色法凋亡检测系统对几种疾病组织(下面)中的DNA降解进行了检测。这种类型的分析能够在组织原位层面上提供细胞死亡机制的信息。凋亡的确认通常需要多方面的证据,如形态学变化和通过DNA laddering证实的核小体降解。使用DeadEndTM比色法凋亡检测系统分析DNA是否降解,是进一步理解疾病状态下的细胞死亡机制的第一步。

移植物抗宿主疾病
移植物抗宿主疾病(GVHD)是骨髓移植的一种严重并发症。在急性GVHD中,皮肤是被攻击的第一靶器官,这种攻击是供体骨髓衍生的淋巴细胞渗透而产生的。最近有研究标明,在该免疫性疾病中,过度的程序性细胞死亡可能与角质细胞受损有关。最终,靶细胞受效应T细胞攻击而受损,被认定是GVHD中的凋亡途径(14,15)。在图5中,样本为GVHD活检标本,使用福尔马林固定,石蜡包埋,切片的基底细胞层使用DeadEndTM比色法凋亡检测系统进行了标记。效应淋巴细胞致使皮肤损伤,导致GVHD皮肤病变中的角质细胞凋亡,上述实验得到的结果与此结论一致。

图5. DeadEndTM比色法凋亡检测系统标记出移植物抗宿主病患者皮肤基底细胞层的一些细胞核。切片为5-10μm的石蜡包埋组织样本。切片按照本系统提供的操作手册中描述的实验方案进行操作(4)。

基底细胞癌
基底细胞癌(BCC)是由紫外线照射触发的一种皮肤疾病。虽然BCC生长较慢,并很少发生转移,但是这种肿瘤细胞可能会侵蚀并破坏周围组织。在这种疾病中,正常的程序性细胞死亡会被抑制。一般认为BCC是一种较活跃的高凋亡活性的增殖性损伤。损伤的严重程度依赖于细胞的增殖速率与死亡速率的比值。BCC细胞表达Bcl-2蛋白,后者会抑制细胞凋亡(16,17)。Bcl-2表达水平的差异可能会影响基底细胞癌的细胞死亡速率。在肿瘤消退的BCC病例中,细胞死亡速率增加。一般认为凋亡会导致肿瘤消退(18)。

在图6中,DeadEndTM比色法凋亡检测系统标记出了肿瘤消退的BCC的组织切片中的多数基底细胞核的凋亡状况。BCC损伤周围区域的淋巴细胞染色也非常明显。一般认为BCC中,肿瘤周围浸润性的T淋巴细胞也发生了细胞凋亡(19)。细胞毒T淋巴细胞和肿瘤基底细胞之间的竞争可能对疾病的结局具有决定作用。

图6. 消退性基底细胞癌中的凋亡检测。切片来自于自发消退性基底细胞癌患者,DeadEndTM比色法凋亡检测系统标记出了损伤区域的基底细胞层的几个细胞(图A)。在损伤区域外的基底细胞,未观察到被标记出的细胞核(图B)。损伤区域附近的几个淋巴细胞被明显标记(图C)。基底细胞层的背景要高于其它被检测的组织。

多发性硬化症
当前,对多发性硬化症(MS)脱髓鞘斑的髓鞘和少突细胞的清除机制进行了深入的研究。在多发性硬化症中,脱髓鞘区域所发生的凋亡发挥着重要作用。在此疾病状态下,浸润细胞和小神经胶质细胞发生凋亡,但是少突神经胶质细胞的细胞死亡途径还没有明确(20-24)。

为了确定MS和其它疾病中发生DNA降解的细胞类型,我们联合使用了比色法的TUNEL技术与抗体着色技术。在细胞增生的慢性MS损伤的脱髓鞘区域,使用Promega的DeadEndTM比色法凋亡检测系统检测细胞凋亡(图7)。DeadEndTM检测系统用于标记凋亡的细胞核(黑色),并使用髓鞘少突神经胶质细胞糖蛋白(MOG)抗体进行双标记,以识别少突神经胶质细胞(红色)。图7中的凋亡细胞为MOG阴性,因此这些凋亡细胞不是少突神经胶质细胞。

图7. 双标记法显示细胞增生的慢性多发性硬化症损伤的部分脱髓鞘区域的凋亡细胞核。使用DeadEndTM比色法凋亡检测系统显示细胞核的片断化降解(使用镍剂增强显色,呈黑色),而使用抗少突细胞糖蛋白(MOG)抗体可以显示髓鞘部分和少突神经胶质细胞体(呈红色)。凋亡细胞为MOG阴性,因此这些凋亡细胞不是少突胶质细胞。使用苏木素复染(蓝色)

总结
我们已经在凋亡的细胞模型和动物模型上证明了DeadEndTM比色法凋亡检测系统的效用。这种比色系统在检测DNA降解的同时,还可以进行细胞或组织的形态学分析。另外,还证明了DeadEndTM比色法凋亡检测系统对于检测疾病组织中的细胞死亡特别有效。这一系统能够与抗体染色联合使用,用于对某些特定的细胞类型或凋亡途径中的其它分子进行标记。

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参考文献
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产品

规格

目录号

DeadEndTM Colorimetric Apoptosis Detection System

40 reactions

G7130

CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay

200 assays

G3582

1,000 assays

G3581

5,000 assays

G3580

CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay

1,000 assays

G1780

 

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