利用Biacore A100以多蛋白组方式进行基于选择性的化合物筛选[创新技巧]

【字体: 时间:2009年02月06日 来源:通用电气

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  Biacore系统以无标记的检测方式来实时监测分子间的相互作用。独特的平行处理能力和灵活性让Biacore A100成为挑选能与复杂的蛋白靶点选择性结合的化合物的有力工具。通用电气供稿,生物通编译

• 提高药物开发中化合物筛选的效率
– 根据选择性结合来筛选化合物
– 无标记、实时筛选虚拟活性化合物(virtual hits)和片段文库化合物

• 利用蛋白质阵列对复杂的蛋白靶点进行快速、高信息量的化合物分析
– 每天的处理速度相当于3800个相互作用
– 与HTS分析相比蛋白靶点的消耗量低

• 可从蛋白质集合(Panels)的平行分析获得独特的化合物筛选标准
– 可同时分析与野生型和突变型蛋白靶点的结合特性、以及与特定靶点蛋白亚基和对照蛋白的结合特性
– 可鉴别出高度选择性结合特定靶点的化合物
– 可最终鉴定出非特异性的蛋白结合物

• 更快速、信息更丰富的化合物筛选,最大程度降低靶点相关的假象风险

• 可实现项目中过去HTS无法进行的重要进程
– 可在生物分析中验证具激动剂活性的化合物

简介
目前的高通量筛选(HTS)方式利用低分子量(LMW)化合物的大文库,通过设计反映化合物与治疗目标蛋白之间的亲和力的抑制性分析来进行筛选。这些分析检测根据阴性结果来检测hits(活性化合物),很容易产生的假阳性结果。例如,化合物可能直接干扰标记系统,或通过非特异的蛋白结合来发生反应。因此,通过高通量筛选分析鉴定出的大部分hits都证实是假阳性,而不能选择性地与目标结合位点结合。

利用结构信息进行虚拟筛选和设计定向文库有助于改善筛选过程。那些可在筛选早期提供全面、高质量的结合和选择性数据的筛选方法将大大提高筛选效率。

“Biacore A100的多重目标蛋白集合分析方式是研究复杂药物靶点的极佳途径。这些分析提高了发现生物活性分子的机会,因为所得的信息给出了结合模式的清晰图像。”
                       ——瑞士巴塞尔罗氏公司的Walter Huber博士

图1. Biacore A100为选择性化合物筛选提供无需标记的相互作用分析方法

无标记的相互作用分析系统在药物筛选过程中的应用日益增多,它的选择标准是基于化合物-靶蛋白的直接结合特性。此类分析的优势包括独特而高分辨率的结合数据为相互作用提供了动态描述,靶蛋白的消耗量小,并且包含对照蛋白用于结合的特异性分析。Biacore™ A100以足够大的运行通量提供高质量的相互作用数据,可满足定向化合物筛选应用中的需求。Biacore™ A100的优势不仅仅在于可处理的化合物数量,这个相互作用分析系统还能够平行分析化合物与一组蛋白的相互作用。实际操作上,在标准的LMW应用中可针对多达16种蛋白(考虑到空白的对照孔)进行分析。这为更高效的化合物筛选开创了新的可能性,利用蛋白集合的方式提供了全面的选择性数据,改善了用于下一步开发的化合物质量。

Biacore A100:聚焦样品或靶点的分析形式

分析系统中共有四个平行、独立的流动池,每一个池可固定多达5种不同蛋白(或其他类型的生物分子)。对于需要最大样品通量的分析而言,在四个流动池中能固定相同的蛋白靶点,这样每个分析循环能平行分析4种不同的样品(图3)。如果有些分析需要优先考虑样品的信息量,则可选在四个流动池中固定多达20种不同的靶点,在每个循环中将1个样品平行注入到所有的流动池中(图6)。

致谢
我们非常感谢罗氏公司(瑞士巴塞尔)提供化合物和蛋白,并对Walter Huber博士在这次合作中的宝贵贡献表示感谢。

研究目的
在与罗氏公司(瑞士巴塞尔)的合作研究中,采用Biacore A100从一个药物筛选计划的1280种化合物中筛选能靶定一个在生物医学上具有重要价值的复杂的异三聚体蛋白(名称保密,暂以HTP代替)的化合物。罗氏的计划旨在开发能与该寡聚蛋白c亚基上的别构位点结合并增加蛋白活性的正协同效应(激动剂活性)化合物。这个目标很复杂,因为已知C亚基别构位点也能够与HTP a亚基上的活性位点相关的同类天然配体结合,这就产生了选择性的问题。由于缺乏单纯的c亚基蛋白,所以筛选方式必须分两步进行(图2概述)。第一步是利用阵列系统分别针对全长HTP和a亚基靶点将所有1280种化合物全都筛选一轮,排除那些倾向于结合a亚基而非全长HTP的化合物。

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然后用一组七个不同的蛋白对上一轮中有希望选择性的化合物进行平行筛选,从而获得化合物高效筛选所需的全面选择性图谱。

图2. HTP靶点的亚基组成和两步法筛选策略示意图。

结论

用全长和a亚基HTP蛋白对1280种化合物进行快速的样品核心筛选(第1轮筛选)

利用全长的HTP(HTP111)和a亚基(HTPa2)靶点对所有1280种化合物进行以最高样品通量为核心的筛选分析。蛋白靶点均固定在每个流动池中,这样每个分析循环能平行分析四种化合物。部分化合物来自针对HTP c亚基的功能结合位点的定向虚拟筛选文库(总数为1160个,分子量范围~200-800 Da),有些则来自极性分子的片段文库(总数为320个,分子量范围~100-400 Da)。基本的分析设置请看图3。

图3. 第一轮筛选的设置。专注于样品的分析筛选出选择性结合全长HTP而非a亚基的化合物。

在每次8小时的运行中,利用384孔板总共可筛选240种化合物,另外加上适当的对照样品和溶剂校正溶液(最大载量是在单次20小时的运行内筛选约1000种化合物)。每一个化合物与靶目标之间的相互作用得到实时监测,由此产生结合反应(通过表面等离子共振SPR来检测)对时间的曲线,称为感应图(详见最后的监测相互反应信息框)。筛选中产生的大量数据由Biacore A100评估软件的自动质量控制(QC)功能来辅助分析,它能鉴别并排除质量差的感应图,从而排除偶然的实验误差。图4展示了每次运行中四处注入对照样品的感应图。

图4. 第一轮筛选中的阳性和阴性对照的感应图。每次运行中4组对照与两个固定靶点的反应分别显示。挑选出用于数据验证的报告点数值恰好在解离期开始之前,如图中箭头所示。

化合物的筛选

每种化合物与两种靶点的结合水平通过离散图进行比较(图5)。这样能鉴定出选择性结合全长HTP而非a亚基的结合物,得到60种化合物进行第二轮筛选中更全面的蛋白集合分析。为了让第二轮筛选包含更宽范围的结合数据,还挑选了一些非选择性的化合物进入第二轮筛选。

图5. 用全盘筛选对化合物进行选择(结果显示一次运行中的240种化合物)。与两种靶点的晚解离期结合水平的离散图。

化合物选择性的综合分析:用7个蛋白对60种化合物进行靶点核心筛选

第2轮筛选采用以靶点为核心的分析方式,利用7个不同蛋白靶点对60种化合物进行结合选择性的综合分析。在这项设置中,每个循环中将一种化合物平行注入四个流动室中,可同时测量与所有固定靶点的结合反应(图6)。

图6. 第二轮筛选的设置。蛋白的详细描述请看表1.注意a亚基靶点HTPa2固定在两个位置上。

选择7种蛋白是为了全方位地鉴定出带指定的结合选择性的化合物,同时降低靶点依赖的假阳性或者假阴性,并最终识别出非特异性蛋白结合。a亚基靶点(HTPa2)被固定在两个流动室中,与另外两种靶点(a亚基突变体和b/c亚基蛋白)做有参考价值的匹配比较,同时可作为一个内在重复性的内参。关于这些蛋白的详细信息请参看表1。

蛋白

描述

注释

HTP111

全长三聚(a1b1c1)异构体-在大肠杆菌中表达

 

HTP221

全长三聚(a2b2c1)异构体-在人细胞系中表达

HTP111相比糖基化显著

HTPa2

a亚基单体

 

HTPa2mt

突变的a亚基

已知功能位点的三处突变

HTPb1c1

b/c-亚基二聚体

 

GST

谷胱甘肽硫转移酶(非特异性结合的对照蛋白)

重组蛋白中常用的标签

CA

碳酸酐酶(非特异性结合的对照蛋白)

HTP无关的药物靶点蛋白

60种化合物连同对照样品在96孔板上进行筛选。在考虑选择性结果的细节之前,可从第二轮筛选中获得一系列基本观察结果。

• 对照化合物与HTP来源蛋白的结合性符合预期模式
• 对照和样品与两种对照蛋白CA和GST的结合程度很低
• 双重固定在两个不同流动池中HTPa2 a亚基靶点在所有检测中得到的结果具有高度一致性,因此所有HTPa2结果都取数值的平均值


从第一轮筛选中选择出的化合物表现出预期的蛋白选择性

比较化合物与HTP111和HTPa2靶点的结合结果,证实了大部分化合物选择性结合全长HTP而非a亚基,尽管它们在选择性程度上差异显著(图7,中间图)。这种表现与分析全部结果时基本上一致,也就是说选择性结合原始全长HTP111蛋白的化合物也同样表现出对全长异构体和b/c亚基蛋白相似的偏向性(图7小图)。

图7. 化合物选择性示意图。小图片显示了有着不同选择性的两种特定的化合物与7种固定蛋白的结合模式(%Rmax=每种蛋白的反应与理论上最大结合反应的百分比)。

蛋白结合反应的配对比较提供化合物特性的独特信息

特定靶点间内涵丰富的配对比较为总体的靶点依赖性质提供了绝佳概述,能鉴定出表现异常行为的特定分子。利用常规的单靶点鉴定策略就无法实现这些观察。图8展示了配对靶点比较的例子,以及由此可得出的结论。

图8. 离散图显示了所有60种化合物与蛋白组中靶点的不同配对组合的相对结合水平(%Rmax)。红色的虚线显示了理论上的1:1(非选择性)结合水平。红圈中的数据点突出了用于评论或总结的特定化合物。

与靶点更高的亲和性并不意味着更好的结合选择性

采用多种蛋白集合筛选方法的动机之一是鉴定出高选择性结合的化合物可能比筛选高靶点亲和力的分子更加重要。因此需要研究这些性质之间的关系。当选择性(由HTP111:HTPa2结合反应的比例来定义)直接与单纯的HTP111结合水平进行比较(图9),很显然这些性质并没有表现出显著的正相关。因此,列入选择性高、中、低组的化合物与全长靶点的结合水平都有高有低。这些结果暗示基于单靶点结合的筛选分析对于鉴定高选择性的化合物来说并不是最优的。

图9. 与全长HTP靶点有高亲和力,与高度选择性结合全长靶点(全长对a亚基)之间不存在相关性

组合靶点评估:多靶点为化合物选择提供了独特的标准

综合的选择性分析显然比配对的靶点比较更具启发性。例如,有人可能会提出全盘筛选有些多余,因为全长对a亚基以及b/c亚基对a亚基的选择性比较应该产生一致的结果。然而,当进行这项比较时,很显然化合物行为更为复杂,而两种HTP来源的靶点都是获得结合选择性的综合图像所必需的(图10)。


图10. 60种化合物的选择性组合分析。以a亚基的结合作为参考,与均等选择性对角线的距离增加表明对b/c亚基(线上)或全长HTP(线下)的选择性程度更高。请看文本中关于1-3化合物组的讨论。

关于b/c亚基(HTPb1c1/HTPa2反应)选择性对全长蛋白(HTP111/HTPa2反应)选择性的分析图表明,尽管许多化合物在象征选择性相等的对角线附近,但也有一些化合物显示出对全长蛋白或b/c亚基的截然不同的倾向性。

图10显示了三组化合物有着完全不同的组合选择性特征:
1. 大多数位于对角线附近说明化合物预期选择性地结合HTP的c亚基,也就是说,与a亚基相比,对全长和b/c亚基靶点的选择性相同。

2. 一些化合物显示出了与全长HTP更强的选择性(相比b/c亚基靶点),提示完整的靶点是最佳结合所必需的。只针对亚基特异性靶点的筛选可能会存在丢失这些潜在的候选药物的风险。

另一些化合物对b/c亚基表现出了强的选择性,而与全长HTP只有很少或没有选择性。这可能反映出b/c亚基上的结合位点在完整的治疗靶点上难以接近。不够全面的筛选将可能鉴定出一些结合性好,但对生物学上的药物靶点没有作用的化合物。

综上所述,这些结果表明针对复杂的治疗靶点进行的高选择性化合物鉴定可能需要综合的集合分析方式,以便排除潜在的靶依赖假象导致的假阳性或假阴性。此外,应用多个对照靶点来鉴定非特异的蛋白结合、与重组蛋白标签的结合,以及可能的表达系统假象,能够应用到几乎所有药物筛选计划中。

利用Biacore A100产生的选择性数据,罗氏制药进行了内部的验证性分析,并将一些最有希望的化合物用于生物及细胞的分析。这些分析的初步结果鉴定出几个具正协同性的(激动剂活性)化合物,表明Biacore A100的高质量结合数据能让药物筛选更有效,最大程度提高了发现生物活性化合物的机会。

总结

• 独特的平行处理能力和灵活性让Biacore A100成为挑选能与复杂的蛋白靶点选择性结合的化合物的有力工具
• 强调样品通量的分析在基本选择标准前提下可实现1300种化合物的快速筛选
• 靶点核心分析可利用扩展的蛋白靶点集合,为鉴定最佳候选者提供全面的选择性信息
• 由多种蛋白集合平行分析获得的独特信息内容,实现了更快、信息更全面的化合物筛选,从而提高了药物开发中的成功几率

参考文献
Huber, W. A new strategy for improved secondary screening and lead optimization using high-resolution SPR characterization of compoundtarget interactions. J. Mol. Recognit. 18, 273-281 (2005)

更多关于无标记相互作用分析的信息请访问:www.biacore.com

方法
分析在Biacore A100样机上运行。HTP蛋白和所有化合物由罗氏公司(巴塞尔)提供。蛋白通过标准的胺偶联固定在羧甲基传感器芯片上(S系列传感器芯片CM5)。

Biacore系统以无标记的检测方式来实时监测分子间的相互作用。相互作用的其中一个作用分子固定在传感器表面,而另一个注入溶液中,流经传感器表面。当注入样品中的分子与固定分子结合,会使传感器表面产生折射率的改变,与质量浓度的变化成正比。利用表面等离子共振(SPR)的现象实时检测这些变化,并以感应图(SPR反应对时间作图)的形式显示数据。感应图展示了化合物形成和解离的全过程,而结合曲线的形状揭示了其动力学结合和解离速率。

感应图通过共振单元(RU)测量的结合反应,提供了整个相互作用的实时信息。相互作用过程中特定时间的结合反应也能选择作为报告点。

(翻译:生物通 余亮;校对:吴青)

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