一种纯化Fab片断的新介质-KappaSelect[新品推荐]

【字体: 时间:2009年03月18日 来源:GE

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  作为潜在的生物药品,抗体片断特别是Fab受到了越来越多的关注,因为它们比单克隆抗体(MAb)具有更多的优势。KappaSelect是专为纯化Fab(kappa)片断而设计的亲和介质,能有效地捕获Fab,获得高纯度和高产量的Fab。KappaSelect是通用电气医疗集团定制设计填料项目的一部分。(GE Healthcare供稿,生物通翻译)

作为潜在的生物药品,抗体片断特别是Fab受到了越来越多的关注,因为它们比单克隆抗体(MAb)具有更多的优势。例如,Fab对于组织渗透表现出更好的药物代谢动力学特性,并能与传统的抗原结合位点无法接近的靶点结合。

KappaSelect是专为纯化Fab(kappa)片断而设计的亲和介质,能有效地捕获Fab,获得高纯度和高产量的Fab。KappaSelect是通用电气医疗集团定制设计填料项目的一部分。

KappaSelect亲和层析介质提供了:
• 通过亲和层析有效、工业规模地捕获Fabs
• Fabs的高结合能力
• 刚性琼脂糖基质,能承受高流速,以及大样品体积的处理,以提高产量
• 非哺乳动物来源的产品,减少了生产Fab在临床应用中法规的顾虑
• 配基脱落水平低,确保了Fab的纯度和产量增加

介质的特征

KappaSelect以高度刚性的琼脂糖基质为基础,能在大规模生产中承受高流速和低反压。它是一种亲和填料,特点是配体能与Kappa轻链的恒定区结合----也就是说,缺乏Kappa轻链恒定区的片断不会与之结合(图1)。因此,KappaSelect能够结合其他包含Kappa轻链恒定区的目标分子,如IgA和IgM。配体通过长的亲水间隔臂与基质相连,使之易于结合目标分子(图2)。配体是基于用人IgG kappa进行筛选的一个单链抗体片断。配体由酵母表达系统产生,发酵和随后的纯化/配制都是在无哺乳动物成分的条件下进行的。KappaSelect的特征总结在表1。

图1. 抗体结构以及KappaSelect配体与Fab片断的结合位点。

图2. KappaSelect的部分结构。

表1. KappaSelect的主要特征
基质                   高度交联的高流速琼脂糖
颗粒大小1        75mm (d50V)
配体                   酿酒酵母中产生的重组蛋白(分子量 13000),与Fab kappa轻链的恒定区结合
配体密度           约为5 mg/ml 填料
结合能力2         约为11 mg Fab/ml 填料
流动速度           20°C,在1 m柱子中,床高20 cm,至少为600 cm/h
                           在<3 bar (0.3 Mpa)利用粘度与水相同的缓冲液
pH稳定性
  长期                3-10
  短期                2-12
工作温度3        4-30°C

1 d50V是体积累积分布的颗粒平均大小
2 利用多孔板和多克隆Fab作为试剂进行测定
3 推荐的长期保存条件:4-8°C,20%乙醇

原理

一般的亲和层析原理是利用一个固定化的配体在适当的结合条件下吸附特定分子或一组分子,并在适当的洗脱条件下释放它们。这些条件取决于靶分子、原料组成、以及层析填料,这些还需要与其他的层析参数(如上样量、流速、床高、再生、在位清洗等)共同研究,从而确定以最高的产品回收率、在最短时间内结合最多靶分子的条件。

利用KappaSelect及推荐缓冲液的标准流程如下:
平衡/洗涤缓冲液:PBS,pH 7.4(0.01 M磷酸缓冲液、0.0027 M KCl、0.14 M NaCl)
洗脱缓冲液:0.1 M 甘氨酸缓冲液,pH 3

1. 用KappaSelect装柱。
2. 用10倍柱体积(CV)的平衡缓冲液平衡。
3. 上样。
4. 用洗涤缓冲液洗涤
5. 用5到10 CV的洗脱缓冲液洗脱。立即加入中和缓冲液(如1 M Tris,pH 7.5-8.5),将洗脱部分调整为生理pH。

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再生可恢复填料的原始功能。取决于样品的性质,再生一般在每个循环后进行,接着用起始缓冲液重新平衡。为了预防污染物随时间而积累,可能需要应用更加严格的步骤(详见在位清洗和处理)。

稳定性

配基通过稳定的氨基键固定在琼脂糖基质上,确保化学稳定性高,脱落少。图3显示了KappaSelect用不同pH值的溶液在20°C条件下储存一星期后的稳定性。在2-12的pH范围内,配基脱落少(渗漏低),当KappaSelect储存在pH1、2和12的溶液中(20°C一星期,图4),对Fab结合能力也只有轻微的影响。在pH值>12时,碳和氮同时释放,表明配体水解。

图3. KappaSelect在不同pH下的稳定性。

图4. KappaSelect储存在不同pH值溶液后的Fab结合能力(测定与对照的百分比)。

脱落分析

测定配基脱落的分析来自荷兰Bio Affinity公司(BAC BV)的网站(www.bac.nl)。

在位清洗(CIP)和处理

在一项研究中,用多种常用的CIP溶液对KappaSelect进行处理。在固定时间间隔测定Fab结合能力(图5)。KappaSelect在pH高达12时,依然表现出良好的稳定性。推荐在清洗步骤中用低pH值的溶液或试剂,如盐酸胍。不过要避免长时间(几天)暴露在pH <2的溶液中,因为琼脂糖基质在低pH下会缓慢分解。pH高于12也要避免,因为在碱性条件下配体稳定性有限。清洗或处理的步骤需要根据每个应用来设计。

图5. KappaSelect在用各种CIP溶液处理后的Fab结合能力(以与对照的百分比确定)。

储存

我们推荐将填料储存在4-8°C、20%乙醇中。KappaSelect以在20%乙醇中预膨胀的形式提供。

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(GE Healthcare供稿,生物通翻译)

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